糙皮側耳堿提水溶性多糖對腫瘤的抑制作用及其機制

孔繁利，孫 新，佟海濱，林 琪，劉 妍，李玉林

（1.吉林大學白求恩醫學院 病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.北華大學基礎醫學院病理生理學教研室，吉林 吉林132013；3.北華大學生命科學研究中心，吉林 吉林132013）

糙皮側耳堿提水溶性多糖對腫瘤的抑制作用及其機制

孔繁利1，2，孫 新3，佟海濱3，林 琪3，劉 妍3，李玉林1

（1.吉林大學白求恩醫學院 病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021；2.北華大學基礎醫學院病理生理學教研室，吉林 吉林132013；3.北華大學生命科學研究中心，吉林 吉林132013）

目的：研究糙皮側耳（Pleurotus ostreatus）堿提水溶性多糖對腫瘤的抑制作用，并探討其作用機制。方法：通過堿液提取、乙醇沉淀、聯合脫蛋白和柱層析方法，分離得到粗皮側耳堿提水溶性多糖WPOP－N1；BalB／C小鼠前肢腋皮下注射S－180肉瘤細胞建立腫瘤小鼠模型，將60只雌性小鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、環磷酰胺陽性對照組（30 mg·kg－1）、WPOP－N1低、中和高劑量組（100、200和400 mg·kg－1），每組10只。除正常對照組外，在每只小鼠的前肢腋皮下注射S－180肉瘤細胞懸液，對照組小鼠給予生理鹽水，模型對照組小鼠給予脂多糖10 mg·L－1。采用ELISA法檢測各組小鼠血清TNF－α水平，評價WPOP－N1對巨噬細胞吞噬作用，NO和TNF－α水平的影響。結果：WPOP－N1低、中和高劑量組小鼠瘤質量分別為（2.38±0.55）、（1.79±0.64）和（1.37±0.51）g，均低于正常對照組［（3.71±0.81）g］（P＜0.05）；WPOP－N1低、中和高劑量組抑瘤率分別為35.8%、51.8%和63.1%；WPOP－N1中、高劑量組荷瘤小鼠血清TNF－α水平高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01）；腹腔巨噬細胞的吞噬能力高于正常對照組（P＜0.05或P＜0.01）；WPOP－N1低、中和高劑量組小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO和TNF－α水平升高（P＜0.05），并具有劑量效應。結論：WPOP－N1具有顯著的體內腫瘤抑制作用，其作用機制可能是活化巨噬細胞分泌NO和TNF－α，并增強巨噬細胞的吞噬能力。

糙皮側耳；多糖；免疫調節；巨噬細胞

側耳屬（Pleurotus）為真菌中最高級的擔子菌綱，廣泛分布于全球各地。目前，全世界已發現的側耳屬約有50多種，我國的側耳資源較為豐富，已知的種類約達36種。在眾多側耳屬成員當中，糙皮側耳（P.ostreatus）因其易于栽培、產量大，成為全世界最重要的人工培育食用真菌之一［1］。糙皮側耳不僅味道鮮美，而且營養豐富，除含有蛋白質、必需氨基酸、脂肪和多種微量元素外，還富含約60%的多糖成分。近年來研究［2－3］表明：真菌多糖是一類重要的生物活性物質，在國際上被稱為生物響應調節因子（biological response modifiers，BRMs）或免疫增強劑。多種真菌多糖可通過刺激免疫系統，調節人體的免疫機能，達到治療多種疾病的目的，具有潛在的臨床應用價值與開發前景［4－5］。有文獻報道：熱水提取得到的糙皮側耳糖復合物具有體內抗Sarcoma－180（S－180）肉瘤細胞的活性，而關于堿提糙皮側耳多糖的研究未見報道。本研究通過系統分級純化，得到糙皮側耳堿提水溶性多糖級份WPOP－N1，通過體內外模型對其免疫調節和抗腫瘤方面的作用進行初步探討，為糙皮側耳的深入研究和開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞株和主要試劑及儀器 雌性BalB／C小鼠60只，體質量18～22 g，由吉林大學實驗動物中心提供（合格證號：SCXK－吉－2010－0002），飼養溫度為（25±2）℃，光照時間為明暗各12 h，飼養于相對濕度為60% 的飼養室中，自由飲水和取食。S－180小鼠肉瘤細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。RPMI 1640培養液（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司），96孔細胞培養板（Nunc），環磷酰胺（江蘇恒瑞制藥公司），二甲基亞砜（北京鼎國生物技術有 限 公 司 ）， 鼠 TNF－alpha ELISA 試 劑 盒（Pepro Tech 公 司），Sepharose CL－6B 凝 膠（Pharmcia公司），DEAE－纖維素、藍色葡聚糖（Blue dextran 2000）和標準相對分子質量葡聚糖（Dextran，Sigma 公 司 ）； 酶 標 儀（BIO－RAD 680），分析天平（Sartorius公司），CO2培養箱（Thermo Scientific公司），高速冷凍離心機（Beckman公司），倒置顯微鏡（Olympus公司）。

1.2 糙皮側耳多糖堿提及純化 將乙醇脫脂處理后的糙皮側耳殘渣烘干，加10倍體積蒸餾水于80℃反復提3次。過濾后將殘渣烘干，向殘渣中加入5倍體積的0.5 mol·L－1NaOH溶液，50℃反復浸提3次。合并提取液后，以冰醋酸進行中和，并減壓濃縮至原體積的1／10，離心去除不溶物，透析過夜。向透析后的提取液中加入4倍體積的95%乙醇，4℃下靜置醇析過夜。經離心后，分別利用乙醇、乙醚對沉淀進行脫脂、脫水漂洗。蒸餾水溶解干燥的沉淀后，利用反復凍融、酶法以及Sevag法聯合除蛋白［6］。除去蛋白后的粗多糖溶液用蒸餾水透析過夜后，冷凍干燥得到糙皮側耳堿提水溶性總多糖WPOP。經蒸餾水溶解和過濾后，進一步利用DEAE－纖維素離子交換和Sepharose CL－6B凝膠過濾柱層析對 WPOP進行分級純化，得到堿提水溶性糙皮側耳多糖主要組分WPOP－N1。

1.3 WPOP－N1基本理化性質分析 利用苯酚硫酸 法、Bradford 法 和 間 羥 聯 苯 法［7－8］分 別 檢 測WPOP－N1中總糖水平、蛋白水平和糖醛酸水平。采用高效液相色譜法（HPLC）測定 WPOP－N1均一度和平均相對分子質量。通過乙酰化衍生后，采用氣相色譜法（GC）檢測WPOP－N1中的單體組成。

1.4 小鼠體內抗腫瘤實驗 將60只雌性小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、環磷酰胺陽性對照組（30 mg·kg－1）、WPOP－N1 低、 中、 高 劑 量 組（100、200 和400 mg·kg－1）。除正常對照組小鼠外，其他各組小鼠的前肢腋皮下注射S－180肉瘤細胞懸液（1×107·m L－1）0.2 m L，注射24 h后，每天灌胃給藥1次，藥物以生理鹽水作為溶劑，連續給藥21 d，對照組小鼠給予生理鹽水，模型對照組小鼠給予脂多糖10 mg·L－1。各組小鼠末次給藥后24 h，眼球取血，制備血清，－20℃保存，用于TNF－α水平的檢測。頸椎脫臼處死小鼠，剝離腫瘤并稱質量，按下式計算抑瘤率：抑瘤率（%）＝（模型對照組平均瘤質量－實驗組平均瘤質量）／模型對照組平均瘤質量×100%。

1.5 小鼠腹腔巨噬細胞培養及其吞噬作用檢測腹腔巨噬細胞的培養［9］：酒精消毒腹膜壁后，向小鼠腹腔注入6%無菌淀粉肉湯溶液（3 m L）。3 d后處死小鼠，用3 m L PBS沖洗腹腔，收集腹腔液，4℃、1500 r·min－1離心10 min，用RPMI 1640完全培養基重懸細胞。調整細胞濃度為1×106m L－1，置于6孔培養板中，37℃培養3 h后，棄去未貼壁細胞，貼壁細胞即為腹腔巨噬細胞。臺盼蘭染色法進行鏡下細胞計數，細胞存活率在95%以上為可用。中性紅法檢測巨噬細胞吞噬作用［10］：向純化后的腹腔巨噬細胞中加入不同濃度WPOP－N1（每孔200μL），繼續培養24 h，吸去上清，每孔加入100μL中性紅溶液（0.075%PBS），繼續培養1 h，用PBS（p H＝7.4）洗去剩余的中性紅后，加入100μL的細胞裂解液（乙醇∶乙酸 ＝1∶1，V／V）完全裂解細胞后，利用酶標儀檢測波長550 nm處的吸收值，吸光值的大小用于反映巨噬細胞的吞噬能力強弱。

1.6 NO生成量的檢測 采用Griess試劑法測定培養上清亞硝酸鹽的含量，間接反映NO的生成量［11］。腹腔巨噬細胞與不同濃度的 WPOP－N1共培養（如1.5方法所述），取上清液與同體積Griess reagent（1%氨基苯磺酰胺，0.1%N－萘基乙二胺，2.5%磷酸）混合，室溫孵育10 min，利用酶標儀在波長570 nm處測量吸光值。以NaNO2作為標準品繪制標準曲線，計算各組小鼠巨噬細胞釋放NO的生成量。

1.7 腫瘤壞死因子TNF－α水平的檢測 取荷瘤小鼠血清和腹腔巨噬細胞與 WPOP－N1共培養（如1.5方法所述）的培養基上清液，利用ELISA試劑盒檢測TNF－α水平。

1.8 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。小鼠瘤質量、血清TNF－α水平、巨噬細胞吞噬能力、NO和TNF－α分泌量均以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 WPOP－N1的基本理化性質分析 WPOP－N1為灰白色粉末，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑。經苯酚硫酸法測定其總糖含量為97.6%，Bradford法和間羥聯苯法測定結果呈陰性反應，說明WPOP－N1中不含蛋白和糖醛酸。HPLC測定WPOP－N1的平均相對分子質量為48200。WPOP－N1經乙酰化修飾后，利用GC分析其單體組成，WPOP－N1主要由甘露糖和葡萄糖構成。

2.2 各組荷瘤小鼠的抑瘤率和血清TNF－α水平WPOP－N1灌胃連續給藥21 d后，WPOP－N1低、中和高劑量組荷瘤小鼠的腫瘤質量顯著減小，環磷酰胺陽性對照組和WPOP－N1低、中、高劑量組抑瘤率分別為71.7%、35.8%、51.8%和63.1%。ELISA試劑盒檢測，WPOP－N1低、中和高劑量組荷瘤小鼠血清TNF－α的濃度升高，并呈現劑量依賴效應，中、高劑量組與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 WPOP－N1的體內抗腫瘤活性及血清TNF－α表達水平Tab.1 The anti－tumor activities of WPOP－N1 in vivo and the expression level of serum TNF－α

2.3 各組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性 與正常對照組（平均吸光值為0.31）比較，模型對照組、WPOP－N1低、中和高劑量組平均吸光值分別為0.65、0.38、0.47和0.62。隨著 WPOP－N1劑量的增加，巨噬細胞的吞噬能力逐漸增強，中、高劑量組與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。WPOP－N1高劑量組作用效果接近模型對照組，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO和TNF－α水平

WPOP－N1各劑量組小鼠腹腔巨噬細胞NO和TNF－α水平升高，具有劑量效應，WPOP－N1高劑量組NO和TNF－α水平基本接近模型對照組（P＞0.05）。

表2 各組小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO和TNF－α水平Tab.2 Levels of NO and TNF－αsecreted by peritoneal macrophages of mice in various groups

3 討 論

自然界中現存的真菌有20～25萬種，中國已報道的食用真菌將近1000種，其中具有傳統藥用價值的達300多種，是有待開發的重要藥用資源寶庫。研究［12］表明：多種食用真菌多糖均具有免疫調節和抗腫瘤作用，其最大的優點是毒副作用少、細胞毒性小，而且藥物質量通過化學手段容易控制。

真菌多糖的提取主要以水提法居多，堿提多糖的構象分析和活性報道較少。為了充分發掘糙皮側耳的藥用價值和糙皮側耳中篩選新型抗癌藥物的先導化合物，本研究利用堿提法分離純化糙皮側耳多糖，并鑒定其生物活性。20世紀90年代，國外學者對糙皮側耳水溶性多糖研究［13］發現：水提糙皮側耳多糖為葡聚糖，并含有少量的甘露糖殘基。本研究采用堿提法獲得的多糖組分WPOP－N1以甘露糖為主，甘露糖與葡萄糖的摩爾比為5.6∶3.3，可能的原因是水提法無法充分細胞壁中的多糖成分，而堿性溶液能夠破壞細胞壁，從而得到水提法無法獲得的多糖組分。李華等［5］利用水提法得到的糙皮側耳糖肽（POGP），S－180荷瘤小鼠口服給藥后，POGP顯示了極強的抑瘤活性。姜自彬等［14］對POGP的理化性質進行深入研究發現：POGP在體外對S－180小鼠肉瘤細胞也具有極強的抑制作用，而對小鼠正常細胞無細胞毒作用。本研究結果表明：WPOP－N1具有很強的體內抗腫瘤效果，但POGP具有選擇性的細胞毒性，可以直接在體外抑制S－180細胞增殖。MTT實驗發現：WPOP－N1沒有細胞毒性，不能在體外直接殺傷腫瘤細胞。上述結果提示：堿提法得到的WPOP－N1與水提法制備的POGP可能擁有不同的抗腫瘤作用機制。

基于以往對多糖免疫調節活性的報道，本課題組進一步研究WPOP－N1對小鼠體液免疫與細胞免疫的影響。本研究檢測荷瘤小鼠血清中TNF－α水平結果顯示：WPOP－N1可以顯著提高荷瘤小鼠血清中TNF－α水平，提示 WPOP－N1的抗腫瘤作用可能在于其免疫調節功能。本研究分離并體外培養小鼠腹腔巨噬細胞結果顯示：WPOP－N1對小鼠巨噬細胞的吞噬能力有明顯的促進作用。此外，NO與TNF－α是巨噬細胞釋放的作為殺傷腫瘤細胞的重要化學介質，本研究采用WPOP－N1刺激后的巨噬細胞培養基上清進行檢測發現：NO與TNF－α的水平均顯著上升，上述結果均說明WPOP－N1能增強小鼠免疫功能。

綜上所述，本研究利用堿提法從糙皮側耳中提取得到新的多糖組分WPOP－N1，后者與水提法得到的POGP具有不同的抗癌作用機制。WPOP－N1對腫瘤的抑制作用主要通過活化免疫功能所介導，WPOP－N1可以明顯改善荷瘤小鼠的免疫功能，并能有效刺激小鼠巨噬細胞的活化狀態。

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Inhibitory effect of water－soluble polysaccharide alkali－extracted from Pleurotus ostreatus and its mechanism

KONG Fan－li1，2，SUN Xin3，TONG Hai－bin3，LIN Qi3，LIU Yan3，LI Yu－lin1
（1.Key Laboratory of Pathobiology，Ministry of Education，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Pathophysiology，School of Basic Medical Sciences，Beihua University，Jilin 132013，China；3.Research Center of Life Sciences，Beihua University，Jilin 132013，China）

Objective To study the inhibitory effect of water－soluble polysaccharide alkali－extracted from Pleurotus ostreatus and to clarify its mechanism.Methods The water－soluble polysaccharide WPOP－N1 from Pleurotus ostreatus were obtained by alkaline extraction，ethanol precipitation，and joint deproteinized and column chromatography methods.Forelimbs of BalB／C mice were subcutaneously injected with S－180 sarcoma cells to establish mouse tumor models.60 BalB／C mice were randomly divided into normal control group，model control group，cyclophosphamide（positive control）group，WPOP－N1 low，medium，high doses groups（100，200 and 400 mg·kg－1），and there were 10 mice in each group.Besides normal control group，the mice in the other groups were subcutaneously injected with S－180 sarcoma cells suspensions，and the mice in normal control group were given saline and the mice in model control group were given lipopolysaccharide.The levels of serum TNF－αsecreted were detected by ELISA method.The effects of WPOP－N1 on macrophage phagocytic function and the levels of NO and TNF－αwere estimated.Results The tumor weights of mice in WPOP－N1 low，medium and high doses groups were（2.38±0.55），（1.79±0.64），and（1.37±0.51）g，respectively，which were lower than that in normal control group（3.71 g±0.81 g）（P＜0.05）；the anti－tumor rates of WPOP－N1 low，medium and high doses groups were 35.8%，51.8%，and 63.1%；the serum TNF－αlevels of mice in WPOP－N1 medium and high doses groups were higher than that in normal control group（P＜0.05 or P＜0.01）；the phagocytic activities of peritoneal macrophages of mice in WPOP－N1 medium and high doses groups were higher than that in normal control group（P＜0.05 or P＜0.01）；the NO and TNF－αlevels secreted by murine peritoneal macrophages in WPOP－N1 low，medium and high doses groups were increased（P＜0.05）and had a dose－response.Conclusion WPOP－N1 has a significantly inhibitory effect on tumor in vivo and its mechanism may be related to activating macrophages to secrete NO and TNF－α，and enhancing the phagocytic activities of macrophages.

Pleurotus ostreatus；polysaccharide；immunomodulation；macrophage

R733

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1091－05

2012－10－15

吉林省教育廳科研基金資助課題（2011－131，2012－171，2012－124）；吉林省科技廳青年基金資助課題（201201143）

孔繁利（1974－），男，吉林省四平市人，副教授，在讀醫學博士，主要從事腫瘤病理學研究。

李玉林（Tel：0431－85619481，E－mail：ylli＠mail.jlu.edu.cn）；孫 新（Tel：0432－64608351，E－mail：sunxinbh＠126.com）