抑制ClC－3表達對順鉑誘導人卵巢癌SKOV3／DDP細胞凋亡的促進作用

于春艷，韓命龍，鐘加滕，孫連坤，劉玉和

（1.北華大學基礎醫學院病理學教研室，吉林 吉林132013；2.吉林市公安局昌邑分局法醫室，吉林 吉林132001；3.吉林大學白求恩醫學院病理生理學教研室，吉林 長春130021）

抑制ClC－3表達對順鉑誘導人卵巢癌SKOV3／DDP細胞凋亡的促進作用

于春艷1，韓命龍2，鐘加滕3，孫連坤3，劉玉和1

（1.北華大學基礎醫學院病理學教研室，吉林 吉林132013；2.吉林市公安局昌邑分局法醫室，吉林 吉林132001；3.吉林大學白求恩醫學院病理生理學教研室，吉林 長春130021）

目的：探討抑制氯離子通道－3（ClC－3）基因表達對順鉑（DDP）誘導的人卵巢癌SKOV3／DDP細胞凋亡的促進作用，為卵巢癌的治療提供實驗依據。方法：轉染pSH1－siRNA－ClC－3重組質粒至人卵巢癌SKOV3／DDP細胞，Western blotting方法檢測轉染重組質粒對ClC－3蛋白表達的影響；MTT法檢測細胞增殖率；Western blotting方法檢測凋亡相關蛋白細胞色素C（Cyt－c）及Caspase－3活化片段蛋白表達。結果：與SKOV3細胞比較，SKOV3／DDP細胞中ClC－3蛋白表達水平增加（P＜0.05）；轉染pSH1－siRNA－ClC－3重組質粒后，SKOV3／DDP細胞ClC蛋白表達水平明顯降低；ClC－3－siRNA聯合DDP作用后，SKOV3／DDP細胞增殖率下降（P＜0.05），Cyt－c和Caspase－3活化片段蛋白表達水平增加（P＜0.05）。結論：pSH1－siRNA－ClC－3可有效抑制SKOV3／DDP細胞ClC－3蛋白的表達，并促進DDP誘導SKOV3／DDP細胞凋亡。

卵巢腫瘤；氯通道－3；順鉑；細胞凋亡

順鉑（cisplatin，DDP）是臨床上常用的抗腫瘤藥物，誘導腫瘤細胞發生凋亡［1］。然而，采用DDP治療時常常發生腫瘤細胞獲得耐藥性［2－3］而使腫瘤治療無效。目前，腫瘤細胞對抗腫瘤藥物發生藥物耐藥的機制仍是研究的熱點，有幾種機制被認為與腫瘤細胞發生耐藥有關，例如藥物在腫瘤細胞內聚集減少、DNA修復損傷能力增強和腫瘤細胞發生凋亡能力降低等，但腫瘤細胞產生耐藥的具體機制還尚不明確。研究［4］發現：細胞凋亡常常伴隨發生凋亡細胞容積減少；而凋亡細胞容積減少常被某些離子通道例如鉀離子和氯離子通道（chloride channel，ClC）傳導增強、導致離子外流所誘導。當凋亡誘導因子刺激后，ClC的正常活性通過引起凋亡細胞容積減少而誘導細胞發生了凋亡［5］。本實驗以人卵巢癌SKOV3、SKOV3／DDP細胞為研究對象，觀察DDP對SKOV3／DDP細胞存活率、凋亡蛋白表達水平的影響，探討ClC－3在卵巢癌細胞發生耐藥中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑 人卵巢癌細胞株SKOV3和SKOV3／DDP購自中國科學院和北京協和醫院。新生小牛血清 購自Gibco公司，Iscove’s Modified Dulbecco’s Media（IMDM）培養基購自Hyclone公司；siRNA表達載體（pSilencer TMneo3.1－H1） 購 自 美 國 Ambion 公 司； 脂 質 體（lipofectamine2000）試劑購自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、質粒提取試劑盒和寡核苷酸合成均購自Takara公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）粉末購自Sigma公司；細胞裂解液RIPA購 自 碧 云 天 公 司；ClC－3、Cyt－c、Caspase－3、Cleaved Caspase－3 和 β－actin 抗 體 均 購 自 Santa Cruz公司；注射用DDP（凍干型）購自齊魯制藥有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 SKOV3和SKOV3／DDP細胞均采用含10% 胎牛血清的IMDM培養液養，于37℃、5%CO2培養箱內培養。2種細胞均采用0.4%胰酶消化傳代培養。DDP耐受型細胞株SKOV3／DDP在培養過程中需要加入1 mg·L－1DDP，以維持SKOV3／DDP細胞表型及耐藥性。

1.3 實驗分組 質粒轉染入SKOV3／DDP細胞內，實驗共分4組：轉染pSilencer 3.1－H1質粒（scramble） 組； 轉 染 pSilencer 3.1－H1 質 粒 ＋DDP（scramble＋cisplatin）組，DDP終含量為6 mg·L－1，給藥 24 h；轉染 pSilencer 3.1－H1－siRNA－ClC－3重組質粒（ClC－3－siRNA）組；轉染pSilencer 3.1－H1－siRNA－ClC－3 ＋ DDP（ClC－3－siRNA＋ cisplatin）組，DDP終含量為6 mg·L－1，給藥24 h。

1.4 重組質粒pSilencerTMneo3.1－H1構建 根據GenBank中人ClC－3基因 mRNA的已知序列（AF191729） 和 本 實 驗 室 前 期 工 作［6］， 在www.amhion.com在線設計siRNA模板序列如下：Sense，3′－AGCTACACAAACTGCTTGACCTATGATTAACCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG－5′；Aniisense，3′－CGGCGAAGCTTTTTCCAAAAAATTAATCATAGGTCAAGCAGCTACACAAACTGC－5′。構建的重組質粒經上海生工生物工程技術服務有限公司自動測序儀進行序列測定。

1.5 MTT法檢測細胞增殖率 各實驗組細胞以104／孔接種至96孔板中，每孔接種量為100μL，每組5復孔，于培養結束前4 h，加入5 g·L－1MTT 20μL。培養結束后，傾去培養基，每孔加入二甲基亞楓（DMSO）150μL，振蕩混勻，使結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度（A）值。設對照組細胞增殖率為100%，其余各組增殖率＝（各組A值／對照組A值）×100%。

1.6 Western blotting法檢測蛋白表達量 待細胞生長到對數生長期時，根據實驗設計分為4組，離心收集細胞，每瓶加入120μL RIPA，混勻，取50μg蛋白質樣品進行SDS－PAGE電泳，轉至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h后，用含0.01%Tween 20的TBS緩沖液（TBST）漂洗3次，每次10 min；加入相應的抗體（1∶200），4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1000），37℃搖床溫育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，采用凝膠圖像分析系統分析拍照，并以β－actin作為內參照。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析。細胞生存率和蛋白表達水平以±s表示，組間樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 SKOV3和SKOV3／DDP細胞中ClC－3蛋白的表達水平 收集細胞，提取細胞總蛋白，Western blotting法 分析2種細胞中的ClC－3蛋白的表達，與SKOV3 細胞（0.33±0.03）比較，SKOV3／DDP 細 胞 中 的 ClC－3蛋 白 表 達 水 平（1.23±0.06）增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 SKOV3和SKOV3／DDP細胞中ClC－3蛋白的表達Fig.1 The expressions of ClC－3 proteins in SKOV3 and SKOV3／DDP cells

2.2 各組SKOV3／DDP細胞中ClC－3蛋白表達水平 與scramble組［（98.0±5.7）%］比較，ClC－3－SiRNA 組SKOV3／DDP細胞內ClC－3蛋白表達水平［（53.7±5.6）%］降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 ClC－3－siRNA 重組質粒作用后SKOV3／DDP細胞中ClC－3蛋白的表達Fig.2 The expressions of ClC－3 proteins in SKOV3／DDP cells after treated with ClC－3－siRNA plasmid

2.3 抑制ClC－3表達后SKOV3／DDP細胞增殖率

對照組細胞增殖率設為100%，scramble＋cisplatin組細胞增殖率為（95.4±5.2）%；ClC－3－siRNA＋DDP組細胞增殖率為（63.5±6.5）%，明顯低于scramble＋cisplatin組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 ClC－3－siRNA作用后SKOV3／DDP細胞凋亡蛋白Cyt－c和Caspase－3活化片段的蛋白表達水平

Western blotting檢測，與scramble＋cisplatin組（0.03±0.02）比較，ClC－3－siRNA＋cisplatin組胞漿Cyt－c（0.53±0.16）和 Cleaved Caspase－3（0.36±0.11）蛋白表達水平增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 DDP作用下 SKOV3／DDP細胞 Cyt－c和 Cleaved Caspase－3蛋白的表達Fig.3 The expressions of Cyt－c and Cleaved Caspase－3 proteins in SKOV3／DDP cells after treated with DDP

3 討 論

DDP是目前臨床上術后常規治療方案中聯合應用較廣泛的一線化療藥物，已在卵巢癌、頭頸部腫瘤和肺癌中卓見成效。與其他抗腫瘤藥物一樣，DDP的抗腫瘤活性以誘導腫瘤細胞發生凋亡為主［1，7］。Cyt－c及 Caspase－3蛋白被認為是線粒體凋亡誘導因子，上述蛋白激活可以啟動細胞凋亡過程［8］。本文作者的前期研究［9］發現：DDP作用的SKOV3細胞中的上述蛋白表達增加，而SKOV3／DDP細胞中上述蛋白沒有表達，提示SKOV3／DDP細胞可能對DDP產生耐藥。細胞凋亡時細胞容積減少，常常發生在Caspase激活之前［4］。ClC阻斷劑NPPB上調K562及RK562細胞的ClC－3表達，使2種細胞對DDP誘導的細胞凋亡不敏感［7］。前期研究［9］結果顯示：與SKOV3細胞比較，DDP對SKOV3／DDP細胞存活率的抑制作用減弱。本研究結果顯示：抑制ClC－3表達增加了DDP對SKOV3／DDP細胞存活率的抑制作用，增加了凋亡相關蛋白Cyt－c和Cleaved Caspase－3表達，提示ClC－3可能參與了腫瘤細胞對DDP產生耐藥性過程。研究［10］發現：氯離子（Cl－）是體內最多的陰離子，其通過跨膜轉運和陰離子通道發揮各種生物功能，已經證明ClC在細胞的生理和病理情況下發揮重要作用，如滲透壓調節、離子分泌、細胞容積調節和細胞遷移及增殖等。抑制氯離子通道ClC－2基因表達，能抑制DDP作用下神經膠質瘤U251細胞的侵襲力［11］。ClC－3通過增加細胞內晚期內吞體的酸性，增加了DDP的耐藥性［7］。DDP作用下，SKOV3細胞中內質網應激蛋白表達明顯增加，而SKOV3／DDP細胞中內質網應激蛋白沒有受影響，推測SKOV3／DDP細胞對DDP耐藥與內質網應激相關因子表達差異有關［9］。抑制ClC－3表達通過抑制自噬而增加了DDP對U251細胞的敏感并增加了 U251細胞凋亡［6］。因此，ClC－3引起SKOV3／DDP細胞對DDP產生耐藥的機制還需進一步深入研究。

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Promoting effect of inhibiting ClC－3 expression on apoptosis induced by cisplatin in human ovarian cancer SKOV3／DDP cells

YU Chun－yan1，HAN Ming－long2，ZHONG Jia－teng3，SUN Lian－kun3，LIU Yu－he1
（1.Department of Pathology，College of Basic Medicine，Beihua University，Jinlin 132013，China；2.Department of Firensic Medicine，Jilin Public Security Bureau Changyi Branch，Jinlin 132001，China；3.Department of Pathophysiology，Norman Bethune College of Medicine，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To observe the promoting effect of inhibiting chloride channel－3（ClC－3）gene expression on the apoptosis of human ovarian cancer SKOV3／DDP cells induced by cisplatin（DDP），and to provide the experimental basis for treatment of ovarian cancer.Methods The recombinant plamid pSH1－siRNA－ClC－3 was transfected into SKOV3／DDP cells.The ClC－3 expression changes in SKOV3／DDP cells transfected with pSH1－SiRNA－ClC－3 was detected by Western blotting.The vitality of SKOV3／DDP cells was measured by MTT assay.The expression levels of apoptosis－related proteins cytochrome C（Cyt－C）and Cleaved Caspase－3 were determined by Western blotting.Results Compared with SKOV3 cells，the ClC－3 expression levels in SKOV3／DDP cells was increased（P ＜0.05）.Transfection of pSH1－SiRNA－ClC－3 suppressed the expression of ClC－3 efficiently in SKOV3／DDP cells（P＜0.05）.The proliferation rate of SKOV3／DDP cells was decreased（P＜0.05），and the cyt－C and Cleaved Caspase－3 expression were increased after treated with ClC－3－siRNA combined with DDP（P＜0.05）.Conclusion pSH1－SiRNA－ClC－3 could suppress the expression of ClC－3 efficiently and enhance the apoptosis induced by DDP in SKOV3／DDP cells.

ovarian tumor；chloride channel－3；cisplatin；apoptosis

R737.31

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1106－04

2012－06－19

吉林省教育廳資助課題（吉教科合字2009第156號，吉教科合字2011第117號，吉教科合字2012第394號）；吉林省科技廳自然科學基金資助課題（201215103）

于春艷（1975－），女，吉林省吉林市人，副教授，醫學博士，主要從事腫瘤病理學方面的研究。

劉玉和（Tel：0432－64608556，E－mail：bhlyh1959＠163.com）