羅格列酮對帕金森病模型小鼠中腦黑質iNOS和IL－6表達的抑制作用及其意義

張 田，魏子峰，秦麗娟，周洪霞，張宇新

（1.河北聯合大學基礎醫學院生理學教研室，河北 唐山063000；2.河北聯合大學基礎醫學院解剖學教研室，河北 唐山063000）

羅格列酮對帕金森病模型小鼠中腦黑質iNOS和IL－6表達的抑制作用及其意義

張 田1，魏子峰2，秦麗娟1，周洪霞2，張宇新2

（1.河北聯合大學基礎醫學院生理學教研室，河北 唐山063000；2.河北聯合大學基礎醫學院解剖學教研室，河北 唐山063000）

目的：探討羅格列酮對帕金森病（PD）模型小鼠中腦黑質中誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和白細胞介素－6（IL－6）的調控作用，并闡明其機制。方法：45只雄性小鼠隨機分為對照組、模型組和羅格列酮處理組，每組15只。采用爬桿實驗法觀察各組小鼠行為學變化；采用免疫組織化學染色和Western blotting法觀察小鼠中腦黑質酪氨酸羥化酶（TH）、iNOS和IL－6的表達。結果：模型組小鼠出現震顫、步態遲緩等PD樣癥狀；小鼠轉身（T－turn）及爬桿時間（T－LA）較對照組顯著延長（P＜0.05）；黑質區TH陽性神經元缺失，炎癥因子iNOS和IL－6陽性細胞明顯增多，蛋白表達水平高于對照組（P＜0.05）；羅格列酮處理組小鼠PD樣癥狀較模型組減輕，T－turn和T－LA少于模型組（P＜0.05），iNOS、IL－6和TH陽性細胞數及蛋白表達水平與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：羅格列酮可能通過抑制炎癥因子iNOS和IL－6表達，對多巴胺能神經元起到保護作用。

帕金森病；酪氨酸羥化酶；誘導型一氧化氮合酶；白細胞介素－6；羅格列酮

目前，帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的治療多采用多巴胺（dopamine，DA）替代療法，但DA替代療法只能起到改善癥狀的作用，不能延緩疾病進程和多巴胺能神經元退變，長期應用DA可能會導致疾病惡化，因此急需找到其他有效的治療藥物。近年研究［1－2］顯示：神經炎癥可能是導致PD多巴胺能神經元丟失的重要因素，炎癥因子引起了多巴胺能神經元變性丟失，因此抗炎治療可能成為PD的重要治療策略之一。羅格列酮是一種常用的治療糖尿病藥物，文獻［3］報道：其在神經系統變性疾病中對神經元有保護作用，而羅格列酮對PD是否有治療作用目前國內外尚無報道。為明確這一問題，本實驗以1－甲基－4－苯基－1，2，3，6四氫吡啶（1－methyl－4－phenyl－1，2，3，6－tetrahyd － ropyridine，MPTP）制備PD小鼠模型，探討羅格列酮能否可以減少PD模型小鼠黑質中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）的表達，從而對多巴胺能神經元產生保護作用，以期為PD的治療尋找新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 45只雄性健康C57BL／6N小鼠，12～14周齡，體質量25～30 g，清潔級，購于北京維通利華公司［SCXX（京）2002－2003］，小鼠均自由進食、飲水，在室溫（25±2）°C單籠喂養。MPTP（Sigma公司，USA）；兔抗鼠iNOS單克隆抗體、UltraSensitive SP超敏試劑盒（福州邁新公司，中國）；兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（Eptomics公司，USA）；預染蛋白 Marker（天津灝洋生物公司，中國）；大鼠抗TH單克隆抗體（Chemicon公司，USA）；羅格列酮（葛蘭素史克公司，英國）。

1.2 動物分組及給藥 小鼠隨機分為模型組、羅格列酮處理組和對照組，每組15只。模型組：小鼠腹腔注射 MPTP（25 mg·kg－1，生理鹽水溶解），每天1次，連續7 d；羅格列酮處理組：在MPTP注射前4 h給予小鼠羅格列酮灌胃預處理（4 mg·kg－1），每天1次，連續7 d；對照組：注射與模型組小鼠等量的生理鹽水。

1.3 組織固定、取材和切片 MPTP第7次注射后12 h，每組隨機取9只小鼠。小鼠腹腔麻醉后，經左心室插管用生理鹽水（室溫）灌注，再用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，迅速切取小鼠中腦黑質部位腦塊，置于4%多聚甲醛中固定48 h（4°C），固定好的腦組織經蒸餾水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋處理，石蠟切片機做連續冠狀切片，片厚5 m，4°C保存備用。每組15只小鼠中，隨機取6只進行Western blotting分析。小鼠麻醉后，迅速斷頭取腦，分離小鼠中腦黑質部分，置入細胞裂解液中，低溫勻漿，4°C震蕩30 min后，12000 min－1、4°C離心15 min，取上清液，－80°C保存備用。

1.4 小鼠行為學檢測 采用爬桿實驗測定各組小鼠行為學改變。在MPTP注射7 d后，將1根長55.0 cm、直徑0.8 cm的木桿上端纏以紗布以防止打滑，作為實驗爬桿。測試時將被測小鼠頭向上置于木桿頂端，分別記錄小鼠轉身時間（T－turn）和完全爬到桿底所需要的時間（T－LA）。每只小鼠測3次，取平均值。爬桿時間參數延長反應小鼠運動功能損害的程度。

1.5 免疫組織化學SP法檢測各組小鼠酪氨酸羥化酶（TH）、iNOS和IL－6陽性神經元數量 切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，用TBS緩沖液p H（7.4±0.2）洗3次，每次5 min；組織切片進行水浴法抗原修復；降至室溫；每張切片加入過氧化氫25μL，阻斷內源性過氧化物酶；每張切片滴加10%正常山羊血清25μL，室溫孵育15 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗鼠iNOS單克隆抗體（1∶150）、兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（1∶150）和大鼠抗TH單克隆抗體（1∶300），4°C過夜；加入二抗（生物素標記羊抗兔IgG，1∶150），室溫孵育20 min；加入鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶溶液25μL，室溫孵育20 min，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。用多巴胺能神經元特異性標志酶TH判定模型小鼠黑質區多巴胺能神經元變化以及炎癥因子iNOS和IL－6的表達變化。采用CMIAS真彩醫學圖像自動分析系統進行陽性細胞計數。各組每只動物取3張腦片，數值相加后取平均值。

1.6 免疫熒光組織化學染色法觀察各組小鼠TH、iNOS和IL－6的表達部位 腦組織切片常規脫蠟至水后，PBS洗3次，每次15 min，正常非免疫動物血清室溫孵育30 min，同一組織相鄰切片分別加入兔抗鼠iNOS單克隆抗體（1∶100）與小鼠抗人TH單克隆抗體（1∶300）的一抗混合液和小鼠抗人TH單克隆抗體（1∶300）與兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（Ser63，1∶100）的一抗混合液，4℃過夜，PBS振洗3次，每次15 min，加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記山羊抗兔IgG（1∶60）和四甲基若丹明異硫氰酸鹽（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC）標記山羊抗小鼠IgG（1∶100）熒光二抗混合液，37℃、60 min，PBS振洗3次，每次15 min，雙蒸水振洗10 min，甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡觀察照相。綠色熒光為iNOS和IL－6表達，紅色熒光為TH表達，橘黃色為雙重熒光染色。

1.7 Western blotting法檢測各組小鼠 TH、iNOS和IL－6蛋白表達量 蛋白定量后取4倍體積樣品緩沖液，95℃變性10 min。蛋白上樣量為每孔30 g，10%SDS－PAGE電泳，將蛋白電轉移至硝酸纖維膜上，依相對分子質量大小切取條帶，加入封閉液，室溫下震蕩2 h后，取相應條帶分別加入兔抗鼠iNOS單克隆抗體（1∶300）、兔抗大鼠IL－6單克隆抗體（1∶200）和大鼠抗TH單克隆抗體（1∶400），4℃過夜。室溫孵育1 h后分別加入二抗（生物素標記羊抗兔IgG，1∶500），室溫孵育1 h；加入鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化酶溶液室溫下孵育0.5 h；DAB顯色，掃描蛋白印跡條帶，作定量分析。

1.8 統計學分析 采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析。各組小鼠T－turn、T－LA、小鼠中腦黑質iNOS、IL－6和TH陽性細胞數及蛋白表達量以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 3組小鼠行為學表現 MPTP注射7 d后，模型組小鼠出現典型PD樣癥狀，表現為豎毛、翹尾、震顫和運動變緩等特征。爬桿實驗中，與對照組小鼠比較，模型組小鼠出現爬桿能力下降，爬桿所需時間顯著延長。羅格列酮處理后，小鼠運動功能得到一定程度改善，表現為爬桿時間明顯縮短。見表1。

表1 3組小鼠轉身時間和爬桿時間的比較Tab.1 Comparisons the time of T－turn and T－LA between various groups （n＝9，±s，t／s）

表1 3組小鼠轉身時間和爬桿時間的比較Tab.1 Comparisons the time of T－turn and T－LA between various groups （n＝9，±s，t／s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group T－turn T－LA Control 2.2±0.6 5.3±1.5 Model 4.9±1.3＊ 13.8±3.7＊Rosiglitazone 3.1±0.9△ 7.7±2.8△

2.2 iNOS、IL－6和TH免疫熒光雙重染色 模型組小鼠中腦黑質區可見TH免疫熒光單標記細胞為紅色（圖1 A和B，見插頁二），iNOS和IL－6免疫熒光單標記細胞為綠色（圖1 C和D，見插頁二），融合圖像可見橘黃色熒光，表明iNOS和IL－6與TH有部分共定位（圖1 E和F，見插頁二），黑質區大多數表達iNOS和IL－6的神經元均為多巴胺能神經元。

2.3 3組小鼠iNOS、IL－6和TH陽性細胞形態和數量 對照組小鼠中腦黑質區偶見iNOS和IL－6陽性細胞，第7次注射MPTP后12 h模型組小鼠中腦黑質區iNOS和IL－6陽性細胞顯著增多，胞質呈棕黃色；羅格列酮處理組iNOS和IL－6陽性細胞較模型組減少。圖像分析，模型組和羅格列酮處理組iNOS和IL－6陽性細胞數比較差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖2（插頁三）和表2。對照組小鼠黑質區TH陽性神經元排列整齊密集，與對照組比較，模型組小鼠中腦黑質區TH陽性神經元大量丟失，羅格列酮處理組TH陽性神經元丟失程度明顯減輕。模型組和羅格列酮處理組TH陽性細胞數比較差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖3（插頁三）和表2。

2.4 3組小鼠IL－6、iNOS和TH蛋白表達水平免疫印跡，對照組小鼠中僅有微量IL－6、iNOS蛋白表達，模型組小鼠中IL－6、iNOS表達水平較對照組顯著升高（P＜0.05）；羅格列酮處理組IL－6、iNOS蛋白表達水平較模型組明顯下降（P＜0.05）；模型組 TH 表達較對 照組降低（P＜0.05），模型組和羅格列酮處理組TH表達量比較差異具有統計學意義（P＜0.05），而羅格列酮處理組與對照組IL－6、iNOS和TH表達量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4和表3。

表2 3組小鼠中腦黑質iNOS、IL－6和TH陽性細胞數Tab.2 The numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

表2 3組小鼠中腦黑質iNOS、IL－6和TH陽性細胞數Tab.2 The numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group iNOS IL－6 TH Control 1.45±0.541.33±0.29140.29±8.75 Model 37.35±6.43＊ 36.45±4.70＊ 85.21±6.31＊Rosiglitazone 8.43±1.19△ 9.13±1.69△ 117.43±7.33△

圖4 3組小鼠中腦黑質IL－6、iNOS和TH蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expressions of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups

表3 3組小鼠中腦黑質IL－6、iNOS和TH蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

表3 3組小鼠中腦黑質IL－6、iNOS和TH蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of IL－6，iNOS and TH in the substantia nigra of the midbrain of mice in three groups（n＝9，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group.

Group IL－6 iNOS TH Control 4.24±0.282.17±0.2419.78±3.13 Model 26.33±3.01＊ 25.32±3.98＊ 11.89±1.47＊Rosiglitazone 7.28±1.42△ 9.10±1.35△ 16.14±1.32△

3 討 論

PD是一種常見于中老年人中樞神經系統的退變性疾病，主要病理特征為黑質致密部多巴胺能神經元進行性變性丟失，使黑質－紋狀體通路DA釋放減少，從而出現靜止性震顫、肌肉強直和運動遲緩等臨床癥狀。盡管目前PD的發病機制仍不是十分清楚，但越來越多的證據［4］表明：炎癥反應可能在PD 發病中起重要作用。研究［5－7］顯示：應用MPTP、6－羥 多 巴 胺（6－hydroxydopamine，6－OHDA）和魚藤酮建立PD動物模型，能顯著刺激炎癥因子如iNOS和IL－6的表達，造成多巴胺能神經元變性丟失。國外學者研究［8］發現：在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立的PD體外模型中，抑制iNOS和IL－6表達，可對多巴胺能神經元起到保護作用。另有研究［9］顯示：PD患者中腦黑質區變性神經元周圍炎癥因子水平顯著升高。本實驗采用MPTP制備PD小鼠模型，于MPTP注射后第7天觀察小鼠黑質區炎癥因子iNOS和IL－6蛋白表達和TH神經元丟失情況，結果顯示：模型組小鼠黑質區TH陽性神經元丟失明顯，同時伴有炎癥因子iNOS和IL－6大量表達，而對照組小鼠未出現上述變化，Western blotting檢測結果也顯示了同樣趨勢。免疫熒光雙標記檢測結果顯示：iNOS、IL－6和TH神經元存在共定位。上述現象表明：多巴胺能神經元丟失可能與炎癥反應存在密切聯系。

目前，PD的治療仍然是控制癥狀為主。左旋多巴是治療PD的首選藥物，但其并不能阻止PD的病程進展，而且長期服用會產生嚴重的副作用。越來越多的研究［10］顯示：炎癥反應可能在PD發病中起了重要作用，因此抗炎治療有望成為治療PD的重要手段之一。米諾霉素能有效地降低炎癥反應，在PD治療中已取得了較好療效。國外學者研究［11］發現：羅格列酮可減少神經系統損傷疾病中神經元的丟失，對神經元起到保護作用。最近文獻［12］報道：在 MPTP所致PD慢性動物模型中，羅格列酮可以減少小膠質細胞PPAR－γ表達，減輕多巴胺能神經元變性丟失。本研究結果顯示：與模型組小鼠比較，羅格列酮處理組小鼠中腦黑質區iNOS和IL－6陽性細胞大幅減少，蛋白水平亦下降，同時TH陽性神經元丟失程度得到明顯減輕。由于MPTP選擇性破壞黑質多巴胺能神經元，導致黑質細胞體、紋狀體神經末梢DA遞質大量減少，從而出現PD樣癥狀。本實驗采用爬桿試驗對小鼠運動功能進行動態評估［13］結果顯示：模型組小鼠產生類似PD樣癥狀體征，肢體協調能力差，表現為爬桿所需時間延長，經羅格列酮處理后運動功能增強，爬桿時間明顯縮短。

綜上所述，在本實驗條件下，MPTP可誘導模型小鼠中腦黑質炎癥介質iNOS和IL－6的高表達，多巴胺能神經元顯著丟失；羅格列酮可抑制iNOS和IL－6表達，使多巴胺能神經元變性丟失現象有所減輕，從而發揮一定的神經保護作用。

［1］Tian L，Zhang S，Xu L，et al.Selenite benefits embryonic stem cells therapy in the animal models of Parkinson’s disease through inhibiting inflammation［J］. Mol Neurodegener，2012，7（Suppl 1）：L25.

［2］Collins LM，Toulouse A，Connor TJ，et al.Contributions of central and systemic inflammation to the pathophysiology of Parkinson’s disease［J］. Neuropharmacology，2012，62（7）：2153－2167.

［3］Escribano L，Simón AM，Gimeno E，et al.Rosiglitazone rescues memory impairment in Alzheimer’s transgenic mice：mechanisms involving a reduced amyloid and tau pathology［J］.Neuropsychopharmacology，2010，35（7）：1593－1604.

［4］Garrido－Gil P，Joglar B， Rodriguez－Perez AI， et al.Involvement of PPAR－γ in the neuroprotective and antiinflammatory effects of angiotensin type 1 receptor inhibition：effects of the receptor antagonist telmisartan and receptor deletion in a mouse MPTP model of Parkinson’s disease［J］.J Neuroinflammation，2012，9：38.

［5］Broom L，Marinova－Mutafchieva L，Sadeghian M，et al.Neuroprotection by the selective iNOS inhibitor GW274150 in a model of Parkinson’s disease［J］.Free Radic Biol Med，2011，50（5）：633－640.

［6］Tsai SJ，Chao CY， Yin MC，et al.Preventive and therapeutic effects of caffeic acid against inflammatory injury in striatum of MPTP－treated mice［J］.Eur J Pharmacol，2011，670（2／3）：441－447.

［7］Hernández－Romero MC，Delgado－Cortés MJ，Sarmiento M，et al.Peripheral inflammation increases the deleterious effect of Cns inflammation on the nigrostriatal dopaminergic system［J］.Neurotoxicology，2012，33（3）：347－360.

［8］Kim IS，Ko HM，Koppula S，et al.Protective effect of Chrysanthemum indicum Linne against 1－methyl－4－phenylpridinium ion and lipopolysaccharide－induced cytotoxicity in cellular model of Parkinson’s disease［J］.Food Chem Toxicol，2011，49（4）：963－973.

［9］Tansey MG， Goldberg MS. Neuroinflammation in Parkinson’s disease：its role in neuronal death and implications for therapeutic intervention［J］.Neurobiol Dis，2010，37（3）：510－518.

［10］Fan L，Wang TL，Xu YC，et al.Minocycline may be useful to prevent／treat postoperative cognitive decline in elderly patients［J］.Med Hypotheses，2011，76（5）：733－736.

［11］Verma R，Mishra V，Gupta K，et al.Neuroprotection by rosiglitazone in transient focal cerebral ischemia might not be mediated by glutamate transporter－1［J］.J Neurosci Res，2011，89（11）：1849－1858.

［12］Carta AR，Frau L，Pisanu A，et al.Rosiglitazone decreases peroxisome proliferator receptor－gamma levels in microglia and inhibits TNF－alpha production： new evidences on neuroprotection in a progressive Parkinson’s disease model［J］.Neuroscience，2011，194：250－261.

［13］Yacoubian TA，Standaert DG.Targets for neuroprotection in Parkinson’s disease［J］.Biochem Biophys Acta，2009，1792（7）：676－687.

Inhibitory effects of rosiglitazone on expressions of iNOS and IL－6 in substantia nigra of mice with Parkinson’s disease and their significances

ZHANG Tian1，WEI Zi－feng2，QIN Li－juan1，ZHOU Hong－xia2，ZHANG Yu－xin2
（1.Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2.Department of Anatomy，School of Basic Medical Science，Hebei United University，Tangshan 063000，China）

Objective To investigate the regulation of rosiglitazone on iNOS and IL－6 in substantia nigra of the mice with Parkinson’s disease（PD），and to clarify the mechanism.Methods 45 male mice were randomly divided into control group（n＝15），model group（n＝15）and rosiglitazone group（n＝15）.The behavioral changes of the mice in various groups were observed by pole climbing experiment；immunohistochemistry and Western blotting methods were used to observe the expressions of iNOS，IL－6 and TH in substantia nigra of the mice.Results The model mice exhibited typical PD－like behaviors，such as tremor，gait retardation；compared with control group，the time of T－turn and T－LA in model group was prolonged，the differences between two groups were significant（P＜0.05）；Compared with control group，TH－positive neurons lost obviously，the numbers of iNOS，IL－6 and TH immunoreactive cells and the expression levels in substantia nigra of the midbrain were increased markedly，and the differences were statistically significant（P＜0.05）.After treated with rosiglitazone，the changes mentioned above were reduced significantly；there were significant differences of the numbers of iNOS，IL－6 and TH positive cells and their protein expression levels compared with model group（P＜0.05）.Conclusion Rosiglitazone may protect the dopaminergic neurons by inhibiting the expressions of iNOS and IL－6.

Parkinson’s disease；tyrosine hydroxylase；inducible nitric oxide synthase；interleukin－6；rosiglitazone

R745

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1124－05

2012－05－20

河北省科技廳自然科學基金資助課題（C2004000689）；河北省博士基金資助課題（05547008D－4）；河北省科學技術與社會發展計劃項目資助課題（04276135）；河北省唐山市科學技術研究與發展計劃項目資助課題（10140201A－15）

張 田（1979－），女，河北省唐山市人，講師，醫學碩士，主要從事帕金森病病因與發病機制的研究。

張宇新（Tel：0315－3726421，E－mail：jpzyx＠163.com）