不同程度間歇性低氧大鼠海馬區磷酸化JNK的表達及其意義

趙雅寧，王紅陽，郭 霞，李 琳，韓曉慶，張盼盼

（1.河北聯合大學康復醫學院，河北 唐山063000；2.河北聯合大學附屬醫院，河北 唐山063000）

不同程度間歇性低氧大鼠海馬區磷酸化JNK的表達及其意義

趙雅寧1，王紅陽2，郭 霞2，李 琳2，韓曉慶2，張盼盼2

（1.河北聯合大學康復醫學院，河北 唐山063000；2.河北聯合大學附屬醫院，河北 唐山063000）

目的：探討不同程度間歇性低氧大鼠海馬區磷酸化JNK表達水平變化，闡明低氧大鼠認知功能障礙的發生機制。方法：96只雄性SD大鼠隨機分成對照組和輕、中、重度間歇低氧組，每組24只。對照組大鼠暴露于空氣中，不同程度間歇低氧組大鼠分別暴露于不同低氧條件（100、75和50 m L·L－1，暴露時間每天8 h，持續8周）。采用Western blotting和免疫組織化學法檢測大鼠海馬區磷酸化JNK蛋白表達水平；采用原位缺口末端標記（TUNEL）法檢測各組大鼠凋亡細胞數量；采用Morris水迷宮法檢測各組大鼠學習記憶功能。結果：與對照組比較，隨低氧時間的延長，輕、中、重度間歇性低氧組大鼠海馬區磷酸化JNK陽性細胞數和JNK蛋白表達水平均增加（P＜0.05），TUNEL陽性細胞增多（P＜0.05）；水迷宮法檢測，輕、中、重度間歇性低氧組大鼠逃避潛伏期時間延長和穿臺次數減少（P＜0.05）。與輕、中度間歇性低氧組比較，在重度間歇性低氧組TUNEL陽性細胞數增多，JNK蛋白表達水平和大鼠逃避潛伏期延長，穿臺次數減少（P＜0.05）；輕、中度間歇性低氧組磷酸化JNK表達水平和TUNEL陽性細胞6周時達高峰，8周時降低，但組間各時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）；重度間歇性低氧組磷酸化JNK表達水平和TUNEL陽性細胞8周時達高峰，組間各時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：不同程度間歇性低氧可導致大鼠認知功能損傷，其機制與激活大鼠海馬區JNK、調控神經細胞凋亡有關。

有絲分裂原活化蛋白激酶；細胞凋亡；免疫組織化學；免疫印跡法；大鼠，SD；間歇性低氧

c－Jun氨基末端激酶（JNK）是有絲分裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）家族重要組成成員，活化后經多級激酶的級聯反應將細胞外刺激信號向細胞內傳遞至細胞核，激活下游的激酶或多種轉錄因子，從而參與細胞各種生物化學反應。現已證實JNK信號活化在多種疾病，如動脈粥樣硬化、腦卒中和神經退行性疾病等病理過程中起關鍵作用［1］。阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣 綜 合 征（obstructive sleep ap1neahypopnea syndrome，OSAHS）是反復發生的低氧／再復氧為特征的慢性睡眠呼吸疾患，流行病學調查［2－3］顯示：OSAHS可造成心臟、腦和腎臟等重要器官的損傷。本研究采用實時氧監測的反饋信號，以濃度結合時間切換的方式，模擬臨床呼吸暫停事件的真實狀態，研究不同間歇性低氧狀態對海馬區活化狀態JNK（磷酸化JNK）表達、神經細胞凋亡和認知功能的影響，探討JNK激活在OSAHS后認知功能損害中的作用，旨在為臨床早期干預提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠96只（北京維通利華公司，合格證號：SCXK（京）2002－003），體質量310～350 g；多克隆磷酸化JNK抗體和內參β－actin購自Cell Signaling公司（美國），TUNEL試劑盒購自中杉生物有限公司（北京）；H－7650透射電鏡購自日本日立公司，Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統購自中國醫學科學研究院藥物研究所，測氧儀購自建德市梅城電化分析儀器廠，低氧控制程序購自天津醫科大學總醫院呼吸科；純氮購自天津六方氣體高科技有限公司；低氧艙由天津醫科大學研制。

1.2 動物分組及模型制備 96只雄性SD大鼠隨機分為對照組和輕、中、重度間歇低氧組，每組24只。分別暴露低氧條件為100、75和50 mL·L－1。每天8：00～16：00將間歇低氧組實驗動物置于模型艙內，向艙內循環充入氮氣和空氣，每次循環2 min，連續給予氮氣30 s，分別維持艙內氧濃度最低至100、75和50 m L·L－1，隨后均復氧至氧濃度為21%。對照組大鼠給予持續充入壓縮空氣。實驗過程中以數字測氧儀監測艙內氧濃度變化，艙內氧濃度維持在各自的氧濃度內，使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內。實驗結束將大鼠取出，送入常規飼養箱內自由飲水與攝食，生活環境和飼養條件相同。各組大鼠每天進行實驗8 h，實驗持續時間為8周；對照組大鼠暴露于正常空氣中。分別在實驗第2、4、6和8周進行Morris水迷宮測試和所設指標檢測。

1.3 免疫組織化學法檢測大鼠磷酸化JNK水平每組各時間點取3只動物，以0.4%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開胸暴露心臟，4%多聚甲醛行心臟灌流，斷頭取腦，在視交叉后1和6 mm處冠狀面切開，取中間塊置4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，切片（片厚5μm）。切片常規脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復，滴加磷酸化JNK抗體（1∶150），濕盒中4℃過夜，IgG抗體－HRP多聚體（PV二步法），置于37℃溫箱30 min，DAB顯色，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對照。鏡下觀察并攝片觀察。

1.4 Western blotting法測定大鼠磷酸化JNK水平 每組各時間點取3只大鼠，致死后迅速取雙側海馬區組織，稱質量0.6 g，以4℃PBS充分洗滌，加入3倍體積4℃全細胞裂解液，冰浴中勻漿；4℃、12000 r·min－1離心5 min，取上清貯存于－80℃備用。考馬斯亮藍法檢測各樣本的JNK蛋白表達水平。檢測步驟：40μg蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10 min，100 g·L－1十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），轉膜，封閉液室溫下震蕩2～3 h，加入磷酸化JNK抗體（1∶1500），4℃孵育過夜，TBST洗膜，37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，以圖像分析儀測定光密度，作定量分析。

1.5 TUNEL法檢測大鼠原位細胞凋亡 標本以多聚甲醛固定，經過脫水、透明、浸蠟、包埋和切片，按TUNEL檢測試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木精復染。陽性率的定量分析：每個標本取4張切片，每張切片在海馬區隨機選取4個視野，在200倍光鏡下應用目鏡網格測試系統，計數陽性細胞，取均值。

1.6 大鼠學習和記憶功能檢測 Morris水迷宮檢測按照Smith等［4］報道的方法。每只大鼠晨起訓練5次后分別在上午、下午各測試6次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時間和撤去平臺后大鼠穿越原平臺位置的次數，取檢測記錄的總均值。

1.7 統計學分析 應用SPSS 16.0統計軟件對數據進行分析。各組大鼠JNK蛋白表達水平、TUNEL陽性細胞數量、逃避潛伏期和穿臺次數以±s表示，多組間比較采用析因設計資料的方差分析，組內比較采用SNK－q分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠磷酸化JNK蛋白表達水平 免疫組織化學分析：磷酸化JNK陽性表達產物主要位于細胞核，少量表達在細胞漿。對照組大鼠海馬區只有極少量的陽性細胞，染色較淡。輕、中、重度間歇性低氧組大鼠海馬區磷酸化JNK表達陽性細胞均呈不同程度增加，陽性細胞主要分布在海馬易敏感區CA1區、其次在CA2、CA3區，齒狀回也有少量分布。重度間歇低氧組大鼠磷酸化JNK陽性反應最強，染色最深；免疫印跡分析：與對照組比較，輕、中和重度間歇性低氧組海馬區磷酸化JNK在各時間點均有不同程度增加（P＜0.05）；輕、中度間歇性低氧組磷酸化JNK表達水平在6周時達高峰，8周時表達水平降低，輕、中度間歇性低氧組內各時間點JNK蛋白表達水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）；但輕、中度間歇性低氧組各時間點比較差異無統計學意義；重度間歇低氧組JNK表達8周達高峰，組內各時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與輕、中度間歇低氧組比較，各時間點磷酸化JNK水平均顯著增多（P＜0.05）。見圖1（插頁三）、2和表1。

圖2 各組大鼠海馬區磷酸化JNK蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of expression levels of phosphorylated JNK protein in hippocampal region of rats in various groups

2.2 各組大鼠海馬區神經細胞凋亡 TUNEL陽性產物主要位于細胞核。對照組大鼠海馬區只有極少數陽性細胞，陽性細胞主要分布在海馬易敏感區CA1區、其次在CA2、CA3區，齒狀回也有少量分布。與對照組比較，輕、中、重間歇性低氧組大鼠海馬區TUNEL陽性細胞在各時間點均不同程度增加（P＜0.05）；輕、中度間歇性低氧組TUNEL陽性細胞數量6周達高峰，8周時減少，輕、中度組組內各時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05）；兩組間比較差異無統計學意義；重度間歇低氧組TUNEL陽性細胞數量8周達高峰，組內各時間比較差異有統計學意義（P＜0.05）；與輕、中度間歇低氧組比較，重度間歇低氧組各時間點TUNEL陽性細胞數量均顯著增多（P＜0.05）。見圖3（插頁三）和表2。

表1 各組大鼠海馬磷酸化JNK蛋白表達水平比較Tab.1 Comparison of the expression levels of JNK protein in hippocampus of rats between various groups （n＝12，±s）

表1 各組大鼠海馬磷酸化JNK蛋白表達水平比較Tab.1 Comparison of the expression levels of JNK protein in hippocampus of rats between various groups （n＝12，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs mild group；＃P＜0.05 vs moderate group；○P＜0.05 vs 8 weeks in mild group；?P＜0.05 vs 8 weeks in moderate group；▲P＜0.05 vs 8 weeks in severe group.

Group Expression level of JNK protein（t／week）2 4 6 8 Control 0.52±0.15 0.48±0.12 0.64±0.18 0.44±0.18 Intermittent hypoxia Mild 1.96±0.82＊○ 2.49±0.96＊○ 5.84±1.17＊○ 3.58±1.02＊Moderate 2.12±0.79＊? 2.96±1.01＊? 6.10±1.12＊? 4.02±1.14＊Severe 2.98±1.09＊△＃▲ 4.68±1.56＊△＃▲ 7.86±1.56＊△＃▲ 9.78±3.41＊△＃

表2 各組大鼠海馬TUNEL陽性細胞數量比較Tab.2 Comparison of the TUNEL positive cell number in hippocampus of rats between various groups （n＝12，±s）

表2 各組大鼠海馬TUNEL陽性細胞數量比較Tab.2 Comparison of the TUNEL positive cell number in hippocampus of rats between various groups （n＝12，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs mild group；＃P＜0.05 vs moderate group；○P＜0.05 vs 8 weeks in mild group；?P＜0.05 vs 8 weeks in moderate group；▲P＜0.05 vs 8 weeks in severe group.

Group Number of TUNEL positive cells（t／week）2 4 6 8 Control 2.40±0.42 2.42±0.38 2.58±0.57 2.74±0.56 Intermittent hypoxia Mild 3.40±0.49＊○ 4.39±0.73＊○ 9.54±1.36＊○ 6.10±0.72＊Moderate 3.68±0.43＊? 4.82±0.84＊? 11.00±1.42＊? 6.64±0.69＊Severe 6.60±0.69＊△＃▲ 9.68±0.79＊△＃▲ 15.94±2.92＊△＃▲ 19.82±2.61＊△＃

2.3 各組大鼠學習記憶功能評估 與對照組比較，輕、中、重間歇性低氧組大鼠逃避潛伏期時間均延長、穿越原平臺位置的次數均減少；輕度和中度組比較差異無統計學意義；與輕、中度組比較，重度間歇性低氧組逃避潛伏期時間延長、穿越原平臺位置的次數減少（P＜0.05）。見表3和4。

表3 各組大鼠逃避潛伏期的比較Tab.3 Comparison of escaping latency of rats between various groups （n＝20，±s，t／s）

表3 各組大鼠逃避潛伏期的比較Tab.3 Comparison of escaping latency of rats between various groups （n＝20，±s，t／s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs mild group；＃P＜0.05 vs moderate group；○P＜0.05 vs 8 weeks in mild group；?P＜0.05 vs 8 weeks in moderate group；▲P＜0.05 vs 8 weeks in severe group.

Group Escaping latency（t／week）2 4 6 8 Control 25.66±2.97 25.40±3.00 24.96±2.98 25.29±3.07 Intermittent hypoxia Mild 32.76±2.02＊○ 38.86±3.18＊○ 49.64±4.71＊○ 34.65±3.25＊Moderate 34.08±2.24＊? 40.24±2.96＊? 52.36±4.66＊? 36.72±3.44＊Severe 49.17±8.87＊△＃▲ 56.47±6.98＊△＃▲ 62.15±7.44＊△＃▲ 68.42±7.91＊△＃

表4 各組大鼠穿臺次數比較Tab.4 Comparison of frequency of crossing the platform of rats between various groups （n＝20，±s）

表4 各組大鼠穿臺次數比較Tab.4 Comparison of frequency of crossing the platform of rats between various groups （n＝20，±s）

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs mild group；＃P＜0.05 vs moderate group；○P＜0.05 vs 8 weeks in mild group；?P＜0.05 vs 8 weeks in moderate group；▲P＜0.05 vs 8 weeks in severe group.

Group Frequency of crossing the platform（t／week）2 4 6 8 Control group 11.57±2.18 10.94±2.40 10.78±1.70 10.65±1.26 Intermittent hypoxia Mild 9.12±1.18＊○ 8.94±1.16＊○ 6.32±1.12＊○ 8.36±1.04＊○Moderate 9.02±1.16＊? 7.98±1.15＊? 6.04±1.00＊? 7.62±1.20＊?Severe 7.68±1.03＊△＃▲ 5.81±1.60＊△＃▲ 4.42±1.25＊△＃▲ 2.87±0.92＊△＃▲

3 討 論

流行病學研究顯示：OSAHS患者認知功能障礙主要表現為注意、集中、記憶和復雜問題解決能力等受損；OSAHS不僅是腦血管病的重要危險因素，同時OSAHS與阿爾茨海默病（AD）發病有密 切 關 聯［5－6］， 因 此 有 必 要 深 入 研 究 繼 發 于OSAHS的神經損傷機制。海馬是腦內認知形成的重要部位。神經影像學研究證實：OSAHS患者海馬萎縮且海馬的體積與學習記憶的改變存在線性正相關關系。本研究結果顯示：低氧時間越長和低氧程度越重則海馬區凋亡神經細胞越明顯，同時水迷宮實驗結果顯示：大鼠搜索安全島潛伏期時間明顯延長，穿臺次數明顯減少，提示間歇低氧造成海馬區神經元丟失是相應的腦功能障礙出現的關鍵環節。本研究中間歇性低氧3組大鼠學習記憶能力檢測指標變化趨勢表明：間歇性低氧損害學習記憶具有 “高度依賴形式”，與臨床實際相符，即OSAHS病程越長，低氧程度越重，造成的認知功能損害程度越嚴重。本研究中重度間歇性低氧組和輕、中度間歇性低氧組中凋亡神經細胞變化存在下降趨勢，可能是輕度和中度慢性間歇性低氧誘導了低氧耐受，啟動大腦內部某些內源性保護機制，而重度慢性低氧狀態下，組織難以對缺氧產生適應性調節，即處于缺氧應激狀態，缺氧應激持續過久導致腦內轉導信號持續處在紊亂狀態，誘導細胞凋亡。

MAPKs信號通路是連接大多數細胞外信號與膜受體、轉錄因子和各基因調節的中央信號通路，其家族成員包括細胞外信號調節激酶（ERK）、JNK和p38 MAPK等。研究［7］顯示：缺血／低氧、紫外線照射、細胞因子刺激和高滲透性休克等多種應激因素可激活MAPKs信號。有文獻［8］報道：活化的JNK信號在多種疾病的病理進程中表現為負性調節作用，其可通過誘導炎癥因子和促細胞凋亡因子的釋放或表達產生損傷作用。全腦缺血－再灌注損傷模型中，抑制磷酸化JNK的表達，可有效地減輕全腦缺血－再灌注引起海馬區域的神經細胞凋亡。老年癡呆的動物模型中，JNK活化與磷酸化Tau蛋白和淀粉樣沉積有關，且JNK激活呈時間依賴性，并隨粉樣沉積的增加而增加［9］。本研究中隨間歇性低氧時間的延長，輕、中、重度低氧動物海馬區磷酸化JNK陽性細胞及其蛋白表達水平均增高，且重度間歇低氧組變化最為顯著，說明JNK活化參與了間歇性低氧對神經損傷的病理過程。與輕、中度間歇性低氧組比較，重度間歇性低氧組磷酸化JNK表達水平持續增高趨勢的原因，可能是不同程度低氧／再復氧，腦內氧化應激狀態不同，腦內某些信號差異激活［10］，導致重度間歇性低氧時JNK信號過度持續活化。本研究中磷酸化JNK和TUNEL陽性細胞在不同程度間歇性低氧組表達變化趨勢一致，同時二者分布區域基本一致，提示間歇性低氧造成的神經細胞凋亡與JNK蛋白激活有關。有研究［11］顯示：JNK活化后從胞質中轉位入核通過磷酸化激活c－Jun、c－Fos和Elk－1等轉錄因子而調節下游凋亡相關靶基因如Fas L、TNF等配體蛋白啟動死亡受體途徑的細胞凋亡；亦可上調BH3－only蛋白如Bim、Bid的表達而活化Bax等促凋亡蛋白介導線粒體途徑的細胞凋亡。在不同程度間歇性低氧狀態下，JNK蛋白激活介導神經細胞凋亡的具體轉錄調控機制有待進一步研究。

綜上所述，本實驗證實了不同程度間歇性低氧可引起JNK蛋白激活、神經細胞凋亡，同時相對于輕度間歇性低氧，重度間歇性低氧更易于造成JNK過度活化，這在一定程度上揭示了OSAHS患者認知功能損害的機制。JNK蛋白激活參與了不同程度間歇性低氧神經損傷的病理機制，但在不同低氧條件下，JNK介導神經損傷的具體機制尚需進一步研究。

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Expression of phosophorylated JNK in hippocampus of rats with different degrees of intermittent hypoxia and its significance

ZHAO Ya－ning1，WANG Hong－yang2，GUO Xia2，LI Lin2，HAN Xiao－qing2，ZHANG Pan－pan2
（1.College of Rehabilitation，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2.Affiliated Hospital，Hebei United University，Tangshan 063000，China）

Objective To investigate the changes of expression levels of posophorylated JNK in hippocampus of rats with different degrees of intermittent hypoxia and to clarify the mechnism of cognitive dysfunction of hypoxia rats.Methods 96 male SD rats were randomly divided into control group（n＝24），mild intermittent hypoxia group（n＝24），moderate intermittent hypoxia group（n＝24）and severe intermittent hypoxia group（n＝24）.The rats in control group were exposed in air，and the rats in intermittent hypoxia groups were exposed respectively in different intermittent hypoxia conditions（100，75 and 50 m L·L－1，8 h everyday for 8 weeks）.The expression levels of phosphorylated JNK proteins were detected by immunohistochemistry and Western blotting methods；the number of apoptotic cells was measured by terminal deoxynucleotidyl transfernase medicated nick end labeling（TUNEL）method；the learning and memory functions were determined by Eight－arm maze.Results Compared with control group，the expression levels of phosphorylated JNK and the number of TUNEL－positive cells in intermittent hypoxia groups were increased obviously in a time－dependant manner（P＜0.05）；Water maze test showed that the escaping latency was prolonged and the frequency of crossing the platform was decreased in a time－dependant manner in mild，moderate and severe interminttent hypoxia group.Compared with mild，moderate intermittent hypoxia groups，the number of TUNEL positive cells was increased；the expression level of JNK protein was increased and the escaping latency was prolonged and the frequency of crossing the platform was decreased in severe intermittent hypoxia group（P＜0.05）.The expression levels of phosphorylated JNK and the numbers of TUNEL－positive cells reached peak at 6 weeks and reduced at 8 weeks in mild and moderate intermittent hypoxia groups and there were no significant difference between different time points in two groups（P ＞ 0.05）；the expression level of phosphorylated JNK and the number of TUNEL－positive cells reached peak at 8 weeks in severe intermittent hypoxia group and there were significant differences between different time points in sever intermittent hypoxia group（P＜0.05）.Conclusion Different degrees of intermittent hypoxia can cause cognitive dysfunction and its mechanism may be related to activating JNK in hippocampus of rats and regulating the neuronal apoptosis.

mitogen－activated protein kinases；apoptosis；immunohistochemistry；Western blotting method；rats，SD；intermittent hypoxia

R56

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1135－06

2012－05－31

河北省科技廳科研基金資助課題（09276103D－11）

趙雅寧（1974－），女，河北省唐山市人，副教授，在讀醫學博士，主要從事呼吸系統疾病診斷及治療研究。

王紅陽（Tel：0315－3726234，E－mail：zyning789＠126.com）