尼可地爾后處理對心肌缺血－再灌注損傷大鼠心肌的保護作用

李悅瑋，張文琪，孫景輝，張科強

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒內(nèi)五科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長春130033；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，吉林 長春130041）

尼可地爾后處理對心肌缺血－再灌注損傷大鼠心肌的保護作用

李悅瑋1，張文琪2，孫景輝1，張科強3

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒內(nèi)五科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心內(nèi)科，吉林 長春130033；3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，吉林 長春130041）

目的：觀察尼可地爾后處理對心肌缺血－再灌注損傷 （MIRI）大鼠心肌的保護作用，并探討其作用機制。方法：26只SD大鼠隨機分為對照組 （8只）、鹽酸異丙腎上腺素 （ISO）組 （8只）和尼可地爾后處理組（10只）。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，ISO組大鼠腹腔注射ISO 5mg·kg－1，每隔24h重復(fù)注射1次，連續(xù)注射3d；尼可地爾后處理組于注射ISO 1h后尾靜脈注射尼可地爾 （1mg·kg－1），每日1次，連續(xù)3d。于第3次注射ISO后24h斷尾取血后處死，檢測各組大鼠血清中乳酸脫氫酶 （LDH）、磷酸激酸 （CK）活性；常規(guī)HE染色觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；免疫組織化學(xué)染色法檢測Caspase－3蛋白的表達；TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡情況。結(jié)果：尼可地爾后處理組與對照組比較血清LDH和CK活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05），但2組均低于ISO組 （P＜0.05）。HE染色，ISO組大鼠局部心肌組織變性壞死，伴有炎細胞浸潤；尼可地爾后處理組大鼠壞死心肌細胞明顯減少，炎癥反應(yīng)輕微；對照組大鼠心肌無異常表現(xiàn)。免疫組織化學(xué)染色，ISO組大鼠大量心肌細胞胞漿表達Caspase－3，對照組和尼可地爾后處理組大鼠Caspase－3無表達。尼可地爾后處理組細胞凋亡指數(shù) （AI）較ISO組明顯降低 （P＜0.01）。結(jié)論：尼可地爾可減輕大鼠MIRI，其作用機制可能與抑制Caspase－3激活、減少細胞凋亡有關(guān)。

心肌缺血－再灌注損傷；尼可地爾；缺血后處理；藥物后處理；細胞凋亡

缺血性心臟病一直是引起患者心力衰竭和死亡的主要原因［1］。冠心病無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，已經(jīng)成為嚴重危害人類健康和致死的主要疾病之一［2］。盡管近年來血運重建技術(shù) （溶栓、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)和冠狀動脈旁路移植術(shù)）已經(jīng)取得了很大進展，但在缺血性心臟病再灌注治療中，如何保護缺血心肌免于心肌缺血－再灌注損傷（myocardial ischemia－reperfusion injury， MIRI）一直是研究熱點。缺血后處理 （ischemic postconditioning，IPO）和藥物后處理因適于臨床操作成為研究熱點。已有研究［3－4］表明：尼可地爾在臨床上作為治療心絞痛的藥物，對缺血－再灌注心肌有保護作用。但目前關(guān)于尼可地爾心肌MIRI的保護作用機制的研究較少。本研究利用大鼠心肌缺血模型，在分子和細胞水平上觀察尼可地爾藥物后處理對缺血－再灌注大鼠心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器 SD大鼠26只，雄性，體質(zhì)量180～200g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng) （許可證號：SCXK－吉2008－0005）；尼可地爾購自Sigma公司，鹽酸異丙腎上腺素 （ISO）購自上海禾豐制藥廠，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、磷酸激酸 （CK）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，Caspase－3購自美國Cell Signaling公司，TUNEL法檢測試劑盒購自Roche公司；GF－D 200型半自動生化分析儀為山東高密彩虹分析儀器公司產(chǎn)品。

1.2 實驗分組及模型制備 將26只SD大鼠隨機分為3組：對照組8只，鹽酸異丙腎上腺素（ISO）組8只，尼可地爾后處理組10只。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水；ISO組大鼠給予腹腔注射ISO 5mg·kg－1，每隔24h重復(fù)注射1次，連續(xù)注射3d。尼可地爾后處理組大鼠于注射ISO 1h后尾靜脈注射 （1mg·kg－1），每日1次，連續(xù)3d。ISO組和尼可地爾后處理組于第3次注射ISO后24h處死，同時處死對照組大鼠。

1.3 大鼠血清樣本的制備 分別于處死大鼠前穿刺尾靜脈或斷尾獲取外周血1mL，3 000r·min－1離心5min，取上清，再于高速低溫離心機13 000r·min－1離心15min，取上清，－20℃凍存?zhèn)溆谩DH 和CK活性檢測按試劑盒說明書操作。

1.4 大鼠心臟病理組織學(xué)檢測標本的制備 第3次注射后24h處死各組大鼠，消毒后取出大鼠心臟，放入PBS中沖洗，10%甲醛溶液固定；常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，行HE和免疫組織化學(xué)染色 （SP法）。TUNEL法具體步驟按照試劑盒說明書操作。標記前用DNA酶處理切片作為陽性對照，用標記液代替TUNEL反應(yīng)液作為陰性對照。在400倍光鏡下觀察心肌細胞凋亡情況，隨機選取10個視野，以心肌細胞凋亡數(shù)占總心肌細胞數(shù)的百分比計算心肌細胞凋亡指數(shù) （AI）。

1.5 AI結(jié)果判定標準 Caspase－3以心肌細胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒，其著色強度高于背景染色者判定為陽性，否則為陰性。TUNEL法以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，否則為陰性。結(jié)果判定由2名觀察者獨立完成，若判定結(jié)果不一致，則2人在共覽顯微鏡下共同觀察判定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 11.0軟件處理數(shù)據(jù)。各組大鼠血清CK和LDH活性以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清CK和LDH活性 LDH檢測，ISO組大鼠血清LDH活性高于對照組 （P＜0.05），尼可地爾后處理組血清LDH活性明顯低于ISO組 （P＜0.05）；CK檢測，ISO組大鼠血清CK活性高于對照組 （P＜0.05），尼可地爾后處理組明顯低于ISO組 （P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清CK和LDH活性Tab.1 The activities of serum CK and LDH of rats in various groups （±s）

表1 各組大鼠血清CK和LDH活性Tab.1 The activities of serum CK and LDH of rats in various groups （±s）

＊P＜0.05compared with control group；△P＜0.05compared with ISO group.

Group n CK［λB／（mU·L－1）］LDH［λB／（U·L－1）］Control 8 44.71±3.83 4 297.70±599.95 ISO 8 61.26±7.69＊ 6 992.37±828.58＊Nicorandil postconditioning 10 47.12±5.09△ 4 700.23±812.67△

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn) HE染色，ISO組大鼠心內(nèi)膜內(nèi)皮不完整，在心肌細胞間可見小血管擴張及少量紅細胞滲出，部分心肌細胞腫脹、變性壞死，心肌組織內(nèi)血管擴張、炎細胞滲出、浸潤和其包繞血管形成的血管周圍炎；尼可地爾后處理組大鼠心肌橫紋清晰，核居中，無明顯組織壞死、血管擴張和炎細胞浸潤輕微。見圖1（插頁四）。

2.3 各組大鼠心肌細胞凋亡情況 TUNEL法檢測，ISO組大鼠可見大量的凋亡細胞，凋亡陽性的細胞核呈棕黃色。尼可地爾后處理組大鼠凋亡細胞明顯減少。對照組、ISO組、尼可地爾后處理組大鼠的AI分別為 （0.66±0.35）%、（22.38±3.65）%和 （7.57±1.84）%。尼可地爾后處理組的 AI明顯低于ISO組 （P＜0.01）。見圖2 （插頁四）。

2.4 各組大鼠心肌組織中Caspase－3的表達 對照組和尼可地爾后處理組大鼠心肌細胞中無陽性物質(zhì)；ISO組注射ISO后3d大鼠心肌細胞胞漿可見大量棕黃色顆粒。見圖3（插頁四）。

3 討 論

2003年，Zhao等［5］首先提出IPO的概念，即于缺血后持續(xù)再灌注前給予多次短暫重復(fù)缺血－再灌注，能提高心肌對缺血－再灌注損傷的耐受性。為缺血性心臟病的治療開辟了新途徑。通常情況下，心肌細胞線粒體鉀通道處于關(guān)閉狀態(tài)，但能被鉀離子開放劑激活，參與保護缺血后的心肌［6］。鉀離子通道開放劑通過促進線粒體基質(zhì)中鉀的攝入，形成穩(wěn)定的鉀離子流，從而抑制鈣超載［7］。鈣超載可引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放 ，許多大分子非選擇性地由胞漿向線粒體擴散，導(dǎo)致線粒體電位破壞和功能障礙，使能量代謝發(fā)生障礙，引起心肌細胞死亡。在缺血預(yù)處理的研究［8－10］中，鉀離子通道開放劑尼可地爾能夠保護缺血性損傷的心肌。尼可地爾通過開放心肌細胞線粒體鉀離子通道，保護線粒體，減輕MIRI，減少心肌細胞壞死或凋亡，從而保護心肌。本研究以保護線粒體為切入點，旨在為臨床心肌缺血缺氧的對癥治療提供新思路。

本實驗利用ISO腹腔注射制作心肌缺血性損傷模型，并觀察尼可地爾后處理對缺血心肌的保護作用。大劑量ISO導(dǎo)致心臟β1受體過度興奮，心率加快，心肌收縮力增加，心肌耗氧增加；β2受體興奮，擴張外周血管，降低外周血管阻力，血壓降低，特別是舒張壓降低，減少冠狀動脈供血，結(jié)果使心肌缺血缺氧［10－12］。血清酶學(xué)變化是心肌損害程度的主要標志，本研究結(jié)果顯示：連續(xù)大劑量給予ISO后大鼠血清CK、LDH活性增高，表明該方法能夠完全模擬心肌損傷的病理生理過程，復(fù)制心肌損傷的模型。尼可地爾后處理能夠減輕ISO對心肌的缺血性損傷。心肌病理學(xué)檢查是心肌缺血損害程度的直接證據(jù)。大劑量ISO注射后，HE染色顯示：心肌細胞發(fā)生變性壞死，伴有大量炎細胞浸潤；免疫組織化學(xué)染色見大量心肌細胞表達Caspase－3；TUNEL染色見大量心肌細胞凋亡。尼可地爾后處理組大鼠HE染色示心肌細胞無明顯變性、壞死，炎細胞浸潤輕微；Caspase－3免疫組織化學(xué)染色顯示：少量大鼠心肌細胞表達Caspase－3；并見少量凋亡的心肌細胞。這些結(jié)果說明心肌缺血影響線粒體功能，導(dǎo)致細胞能量代謝障礙，激活Caspase－3細胞凋亡途徑，引起心肌細胞發(fā)生不可逆性損傷甚至壞死。

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Protective effect of nicorandil postconditioning on myocardium of rats with myocardial ischemia－reperfusion injury

LI Yue－wei1，ZHANG Wen－qi2，SUN Jing－h(huán)ui1，ZHANG Ke－qiang3
（1.Department of Pediatrics，F(xiàn)irst Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Cardiology，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130033，China；3.Department of Medical Adminisitration，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China）

ObjectiveTo explore the protective effect of nicorandil postconditioning on myocardium of rats with myocardial ischemia－reperfusion injury （MIRI）in rats and to discuss its mechanism.Methods26SD rats were divided into control group （n＝8），isoproterenol（ISO）group （n＝8）and nicorandil postconditioning group （n＝10）.The rats in ISO group were injected intraperitoneally with isoproterenol（5mg·kg－1）at an interval of 24h for 3d；the rats in control group only

an injection of same amount of saline；the rats in nicorandil postconditioning group were injected intravenously with nicorandil（1mg·kg－1）1hafter ISO injection once a day，lasting for 3d.The rats were killed 24hafter the third injection of ISO.The activities of serum creatine kinase（CK）and lactate dehydrogenase（LDH）of rats in various groups were detected；the histopathological changes of myocardium of rats in various groups were observed by routine HE staining；the expressions of Caspase－3protein were determined by immunohistochemistry；the apoptosis of cardiocytes of rats in various groups was analyzed by TUNEL staining.ResultsThere were no significant differences in the activites of serum CK and LDH between nicorandil postconditioning group and control group （P＞0.05），but the activities of CK and LDH in control and nicorandil postconditioning groups were lower than those in ISO group（P＜0.05）.The HE staining results showed local degeneration，necrosis and inflammation in ISO group，but slightly necrosis and inflammation in nicorandil postconditioning group and no pathological changes in control group.Immunohistochemistry staining showed that Caspase－3was positive in cardiocyte plasma in ISO group；however，there were no Caspase－3expression in control and nicorandil postconditioning groups.The apoptosis index （AI）in nicorandil postconditioning group was significantly decreased compared with ISO group （P＜0.01）.ConclusionNicorandil can attenuate MIRI of rats，and its mechanism may be related to inhibiting Caspase－3pathway and decreasing the cardiocyte apoptosis.

myocardial ischemia－reperfusion injury；nicorandil；postconditioning；pharmacological conditioning；apoptosis

R542.2

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1160－04

2012－06－13

吉林省衛(wèi)生廳科研基金資助課題 （2009z004）

李悅瑋 （1975－），女，吉林省長春市人，講師，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事心血管疾病的基礎(chǔ)和臨床研究。

張科強 （Tel：0431－88796754，E－mail：zhangkeqiang＠yahoo.com.cn）