環磷酰胺對兒童系統性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞亞群變化的影響

劉 濤，趙 令，張彥東，王 凱，馬 寧，姜振宇

（吉林大學第一醫院風濕免疫科，吉林 長春130021）

環磷酰胺對兒童系統性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細胞亞群變化的影響

劉 濤，趙 令，張彥東，王 凱，馬 寧，姜振宇

（吉林大學第一醫院風濕免疫科，吉林 長春130021）

目的：探討環磷酰胺對兒童系統性紅斑狼瘡 （SLE）患者外周血淋巴細胞亞群變化的影響，為治療兒童SLE提供依據。方法：選取30例兒童SLE患者和30例健康兒童，檢測其外周血T細胞、B細胞、自然殺傷 （NK）細胞和自然殺傷T（NKT）細胞水平。將SLE患者分為單純激素治療組和環磷酰胺聯合激素治療組，每組各15例，采用流式細胞術檢測2組治療前后兒童外周血淋巴細胞亞群比率的變化。結果：與健康對照組比較，SLE患兒組CD3＋CD4＋Th細胞比率明顯降低 （P＜0.05）；CD3＋CD8＋Tc細胞比率明顯升高 （P＜0.05）；CD3－（CD16CD56）＋NK和CD3＋（CD16CD56）＋NKT細胞比率明顯降低 （P＜0.05），而CD3－CD19＋B細胞比率明顯增高 （P＜0.01）。兒童SLE患者外周血CD3＋CD8＋Tc細胞比率與SLE活動指數 （SLE DAI）呈正相關關系 （r＝0.754 7，P＜0.01）；CD3－CD19＋B細胞比率與SLEDAI亦呈明顯的正相關關系 （r＝0.158 6，P＝0.029 3）；Th、NK和NKT細胞比率與SLE DAI無明顯相關性 （P＞0.05）。與治療前比較，單用激素治療組患者治療后B細胞比率明顯降低 （P＜0.05）；NK、NKT和Th細胞比率均有所升高，Tc細胞比率降低但差異無統計學意義 （P＞0.05）。環磷酰胺聯合激素組治療后患者B細胞比率較治療前明顯降低 （P＜0.01），NK細胞、Th細胞比率較治療前明顯升高 （均P＜0.01）。結論：兒童SLE患者淋巴細胞亞群比例的失調與SLE的發病有關，環磷酰胺聯合激素治療兒童SLE效果較好。

系統性紅斑狼瘡；環磷酰胺；淋巴細胞亞群；兒童

與成人比較，兒童系統性紅斑狼瘡 （systemic lupus erythematosus，SLE）臨床表現更加復雜多樣，癥狀較重，治療存在難度，病因和發病機制尚不清楚。普遍認為：T、B細胞在SLE的發生發展中起關鍵作用，且自然殺傷 （natural killer，NK）細胞和自然殺傷T （natural killer T，NKT）細胞亦與SLE發病密切相關。環磷酰胺是臨床常用的免疫抑制劑，可以抑制體液和細胞免疫而起到治療SLE的作用。研究［1］證實：環磷酰胺可影響不同的T細胞亞群，導致CD4＋／CD8＋比值變化，并可抑制B細胞的產生，從而減少自身抗體的數量。但目前關于環磷酰胺對兒童SLE患者淋巴細胞亞群的影響研究較少。本研究旨在探討環磷酰胺對兒童SLE患者外周血淋巴細胞亞群的影響及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年1月—2012年1月本院兒童SLE患者 （≤16歲）30例，男性2例，女性28例，平均年齡 （10.0±4.2）歲；SLE活動指數 （SLE DAI）為3～35，平均為13；抗－雙鏈DNA陽性率為80%，補體C3為0.48（0.30～0.91），補體C4為0.10（0.03～0.19）。30例患者隨機分為單純激素治療組和環磷酰胺聯合激素治療組，每組15例。單純激素治療組患者給予潑尼松龍1mg·kg－1·d－1靜點，環磷酰胺聯合激素治療組患者給予環磷酰胺每周0.4g、聯合1.0mg·kg－1·d－1潑尼松龍，治療4周。所有患者診斷均符合1997年美國風濕學會 （ACR）修訂的SLE分類診斷標準［2］。疾病活動指數參照SLE DAI評分，分數≥6為疾病活動期。所有患者均為初發SLE，排除系統性硬化、肌炎或其他自身免疫疾病，或過去的6個月已經給予免疫抑制劑或糖皮質激素治療的SLE患者。在門診選取30例健康兒童作為健康對照組，男性2例，女性28例，平均年齡 （11±3）歲，各組兒童年齡、性別差異無統計學意義 （P＞0.05）。

1.2 流式細胞術檢測各組兒童外周血淋巴細胞亞群比例 每個兒童采集150μL血液，平均分配至3個采樣管中。第1個采樣管中加入異硫氰酸熒光素 （fluorescein isothiocyanate，FITC）耦聯CD4單克隆抗體、多甲藻黃素－葉綠素－蛋白質復合物（peridinin－chlorophyll－protein complex，PerCP）耦聯CD3單克隆抗體和聚乙烯 （polyethylene，PE）耦聯CD8單克隆抗體各5μL；第2個采樣管中加入FITC耦聯CD3單克隆抗體和PE耦聯CD19抗體各5μL；第3個采樣管中加入FITC耦聯CD3單克隆抗體和PE耦聯CD16CD56單克隆抗體各5μL。樣本在室溫下放置0.5h后，加入FACS紅細胞裂解液 （美國BD公司產品），靜置6min。用PBS緩沖液洗2次，應用流式細胞儀的數據分析軟件 （v5.7.2）分析各組兒童淋巴細胞亞群比率。

1.3 統計學分析 采用SPSS 14.0統計軟件分析數據。各組兒童外周血各淋巴細胞亞群比率以±s表示，組間比較采用χ2檢驗。淋巴細胞亞群比率與SLE DAI的相關性分析采用等級相關分析。

2 結 果

2.1 各組兒童外周血各淋巴細胞亞群的變化 兒童SLE患者CD3＋CD4＋Th細胞比率 （26.930%±1.682%）明 顯 低 于 健 康 對 照 組 （38.420% ±1.301%） （P＜0.01）；而患兒CD3＋CD8＋Tc細胞比率 （32.590%±2.096%）較健康對照組患兒（19.570%±1.155%）明顯升高 （P＜0.01）；兒童SLE患者CD4＋／CD8＋比值顯著下降；兒童SLE患 者 CD3－（CD16CD56）＋NK 細 胞 比 率（5.606%±0.348%）、CD3＋（CD16CD56）＋NKT細胞比率 （0.973%±0.091%）較健康對照組［（14.550%±0.482%）、（4.433%±0.284%）］明顯降低 （P＜0.01）；而患兒CD3－CD19＋B細胞比率 （15.300%±1.644%）較健康對照組兒童（7.406%±0.457%）明顯增高 （P＜0.01）。見圖1。

圖1 SLE組與健康對照組兒童各淋巴細胞亞群比率Fig.1 The ratios of lymphocyte subsets of children in SLE and health control groupsA：Th cells；B：Ts cells；C：NK cells；D：NKT cells；E：B cells.

2.2 兒童SLE外周血淋巴細胞亞群比率與SLE DAI的相關性分析 兒童SLE患者外周血CD3＋CD8＋Tc細胞比率與SLE DAI呈正相關關系 （r＝0.754 7，P＜0.01）。CD3－CD19＋B細胞比率與SLE DAI亦呈明顯的正相關關系 （r＝0.159，P＝0.029，）。Th （r＝0.256，P＝0.625）、NK （r＝0.458，P＝0.089）、NKT （r＝0.574，P＝0.376，）細胞比率與SLEDAI有明顯相關性。

2.3 各組患者外周血淋巴細胞亞群比率 單用激素治療組治療后患者B細胞比率 （10.180%±1.360%）較治療前 （16.400%±2.171%）明顯降低 （P＜0.05）；NK細胞比率 （8.741%±0.462%）、NKT細胞比率 （1.375%±0.028%）和Th細胞比率 （30.250%±0.987%）均較治療前 （5.587%±0.198%）、 （0.987%±0.123%）和 （23.540±1.225%）升高，Tc細胞比率治療后 （30.120%±1.547%）較治療前 （33.710%±2.581%）降低，但治療前后差異無統計學意義 （P＞0.05）。環磷酰胺聯合激素組患者治療后CD3＋CD4＋Th細胞比率 （40.620%±1.118%）、CD3－（CD16CD56）＋NK細胞比率 （14.380%±0.665%）較治療前（26.460%±2.886%）、（5.807%±0.501%）明顯升高 （P＜0.01）。CD3－CD19＋B 細 胞 比 率（6.934% ±0.651%） 較 治 療 前 （14.200% ±2.514%）明顯降低 （P＜0.01）。見圖2。

圖2 治療4周后單用激素組與環磷酰胺聯合激素組SLE患兒B、Th和NK細胞比率Fig.2 The ratios of B，Th and NK cells of SLE patients in hormone therapy group and cyclophosphamide combined with hormone therapy group 4weeks after treatmentA：Hormone therapy group；B－D：Cyclophosphamide combined with hormone therapy group；A，B：B cells；C：Tc cells；D：NK cells.

3 討 論

兒童SLE是兒童常見的、嚴重的自身免疫性疾病，T細胞亞群的紊亂可能在疾病的發生、發展中發揮著重要的作用，而CD4＋T細胞與CD8＋T細胞的相互制約與平衡對機體免疫應答具有重要的調節作用。本研究結果顯示：兒童SLE患者中CD8＋T細胞較健康組明顯升高，CD4＋T細胞明顯降低，CD4＋／CD8＋比值顯著下降。而既往研究［3－4］顯示：SLE患者中CD4＋T細胞增多或CD8＋T細胞減少、CD4＋／CD8＋比例異常，因此認為SLE的發病是由于CD8＋T細胞亞群的減少、功能缺陷所致的B細胞多克隆抗體激活和體液免疫異常所致。但也有研究［5］顯示：大部分SLE患者外周血中CD8＋T細胞數量未見降低，尤以具有反抑制活性的CD8＋T細胞高表達最為明顯，因此不能發揮CD8＋T細胞對于CD4＋T細胞的抑制作用，同時由于CD4＋T細胞的減少，尤其是具有抑制誘導作用的T細胞的減少，不能誘導CD8＋T對B細胞產生抑制作用［6－7］，因此SLE患者雖有CD4＋T減少，CD8＋T正常或稍高，但仍表現為體液免疫亢進，B細胞增殖并產生大量自身抗體。B細胞的功能異常在SLE的發病機制中發揮著重要的作用。本研究結果顯示：兒童SLE患者中B細胞比率較健康對照組明顯升高。傳統觀點認為：B細胞在SLE的發病過程中是抗體依賴性的，但新近有研究［8］顯示：B細胞的抗原提呈、激活T細胞并促進其分化、調節樹突細胞等功能異常，可能在SLE的發病過程中起更為重要的作用。

NK細胞作為天然免疫系統的一部分，不僅具有自然殺傷功能，對腫瘤細胞和病毒感染細胞有較強殺傷作用，而且對體內多種細胞，尤其是T、B細胞具有免疫調節作用。本研究結果顯示：SLE患者NK細胞數量明顯降低，與此前的研究［9－10］結果相似，治療后NK細胞較治療前升高，提示NK細胞的變化可以直接地反映機體的免疫失衡狀態。有研究［11－12］顯示：體內較高水平的循環免疫復合物可能是導致NK細胞數量減少和細胞毒作用低下的重要原因。NKT細胞是一種特殊類型的T細胞，同時表達NK細胞和T細胞標記，是獲得性免疫和天然免疫連接的橋梁。近年來，有文獻［13－14］報道：NKT細胞數量的減少和功能缺陷與SLE的發病有關，但具體作用仍需進一步研究。本研究結果顯示：SLE患者NKT細胞比率明顯降低，與文獻［13－14］報道結果一致。本研究結果顯示：淋巴細胞各亞群比率與SLE DAI有相關關系，T細胞亞群、B細胞和NK細胞的改變在SLE的發病中起重要作用，故檢測SLE患者外周血淋巴細胞亞群可了解機體的免疫狀態，對正確判斷病情和指導臨床治療有重要意義。

由于大多數的SLE患兒均累及內臟，而且病情變化較快，所以大部分患兒需以激素作為首選治療藥物。糖皮質激素對免疫細胞的許多功能以及免疫反應的各個環節均有明顯的抑制作用，尤其對細胞免疫的作用突出；大劑量應用激素時還可明顯抑制體液免疫反應，減少抗體產生；超大劑量應用激素則有直接的淋巴細胞溶解作用。本研究結果顯示：單用激素4周后，B細胞比率明顯降低，NK、NKT和Th細胞比率均較治療前升高，Tc細胞比率較治療前降低，但兩組間差異均無統計學意義，可能是因為樣本量不足和時間有限所致。環磷酰胺可以影響T細胞亞群，造成CD4＋／CD8＋比值改變，同時還可以抑制B細胞的生成和抗體數量減少，是治療重癥SLE的有效藥物，特別是針對狼瘡性腎炎患者。本研究結果顯示：環磷酰胺聯合激素治療4周后，Th細胞比率較治療前明顯升高，超過基線水平，十分接近健康對照組水平，B細胞比率較治療前明顯降低；另外治療后NK細胞比率較治療前也有所升高，治療前后細胞比率的變化均有統計學意義。而單用激素組治療患者，與治療前比較，僅B細胞比率的降低差異具有統計學意義，其他細胞并未發生具有統計學意義的變化。本研究結果表明：激素和環磷酰胺均可以引起T細胞亞群的變化，環磷酰胺聯合激素治療SLE的效果明顯優于單用激素。

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Effects of cyclophosphamide on changes of lymphocyte subsets in peripheral blood of children patients with systematic lupus erythematosus

LIU Tao，ZHAO Ling，ZHANG Yan－dong，WANG Kai，MA Ning，JIANG Zhen－yu
（Department of Rheumatology，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo explore the effect of cyclophosphamide on changes of lymphocyte subsets in peripheral blood of children patients with systematic lupus erythematosus（SLE）and to provide evidence for curing children with SLE.Methods30children with SLE and 30healthy children were selected.The levels of T cells，B cells，NK cells and NKT cells in peripheral blood were detected.The SLE patients were randomly divided into hormone therapy group （n＝15）and cyclophosphamide combined with hormone therapy group （n＝15），the changes of the levels of lymphocyte subsets in peripheral blood before and after treatment were detected by flow cytometry.ResultsCompared with healthy control group，the ratio of CD3＋CD4＋Th cells in SLE patient group was decreased obviously （P＜0.05）；the ratio of CD3＋CD8＋Tc cells was markedly increased （P＜0.05）；the ratios of CD3－（CD16CD56）＋NK and CD3＋（CD16CD56）＋NKT cells were decreased obviously （P＜0.05）；the ratio of CD3－CD19＋B cells was markedly increased（P＜0.01）.The ratio of CD3＋CD8＋Tc cells in peripheral blood of children with SLE was positively related to SLE DAI（r＝0.754 7，P＜0.01）；the ratio of CD3－CD19＋B cells was also positively related to SLE DAI（r＝0.158 6，P＝0.029 3）.The ratios of Th，NK and NKT cells were not related to SLE DAI （P＞0.05）.Compared with before treatment，the ratio of CD3－CD19＋B cells was significantly decreased after treatment in hormone therapy group （P＜0.05），and the ratios of NK，NKT and Th cells were increased and the ratio of Tc cells was decreased，but there was no significant difference（P＞0.05）.In cyclophosphamide combined with hormone therapy group，the ratio of B cells was decreased after treatment，but the ratios of NK，NKT and Th cells were increased compared with before treatment（P＜0.01）.ConclusionThe imbalanced proportion of lymphocyte subsets in the children with SLE is involved in the pathogenesis of SLE，and the treatment of cyclophosphamide combined with hormone is more effective.

systematic lupus erythematosus；cyclophosphamide；lymphocyte subset；children

R593.24

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1168－05

2012－06－29

吉林省科技廳科研基金資助課題 （201115051）

劉 濤 （1980－），男，吉林省長春市人，醫師，醫學碩士，主要從事系統性紅斑狼瘡的研究。

姜振宇 （Tel：0431－88782060，E－mail：jlujzy＠yahoo.com.cn）