腫瘤干細胞分離鑒定方法的研究進展

程俊美 謝 峰 王 慧

山東菏澤醫學專科學校病理學教研室

早在19世紀中期就有科學家在顯微鏡下發現腫瘤細胞與干細胞十分形似。到20世紀50年代前后，Lorentz等的骨髓移植實驗成功，表明在造血細胞中存在一類原始的造血細胞即造血干細胞(HSC)，它們具有自我更新或自我復制的能力，能向骨髓中的各系細胞分化，以維持機體的正常造血功能。許多學者提出腫瘤干細胞(CSC)假說，Reya等[1]認為腫瘤組織中存在極少量腫瘤細胞充當干細胞的角色，具有無限增殖的潛能，在啟動腫瘤的形成和生長中起著決定性的作用。

之后，研究者們又從人和動物的多種腫瘤及腫瘤細胞系中分離鑒定出了CSC。根據目前已有的研究，對于CSC的分離純化主要有根據細胞表型特征和生物學特性而建立的兩大類方法，即依賴于細胞表面標志的分離方法和根據干細胞外排DNA結合熒光染料Hoechst33342而建立的SP細胞分離法。

1 依賴細胞表面標志的分離方法

要通過表面標志對CSC進行分離，必須確定CSC的特異性表面標志(或標志物組合)。考慮到CSC既屬于腫瘤細胞也類似于正常干細胞的特性，對CSC分離標志選擇的一般原則為：結合譜系標志——CSC一般不表達分化的譜系標志即Lin-(譜系標志：CD2、CD3、CD10、CD16、CD18、CD31、CD64、CD140b)；正常干細胞特異性標志——如分離BTSC的CD133和分離LSC的CD34[2]等；以及正常組織特異性標志——如分離乳腺癌的上皮特異性標志ESA等進行綜合評價；除此之外，結合陽性標志和陰性標志可以更有效地分離腫瘤干細胞。目前，已經用這種方法分離鑒定出了多種腫瘤的CSC。

1.1 造血系統腫瘤干細胞1997年，Bonnet等用放射線照射非糖尿病型重癥聯合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠，破壞其骨髓后導入人造血干細胞，觀察到有新的血細胞產生。他們又用同樣的方法發現只有很少的急性髓細胞白血病(AML)細胞可在小鼠體內形成AML移植瘤，用各種細胞表面標志對這些AML的起始細胞進行研究，發現這些細胞并不帶有成熟細胞的標志物，而是表型為CD34+CD38-的細胞亞群。該細胞群具有明顯的增殖、分化和自我更新能力，只需要5×103就可以在NOD/SCID小鼠體內形成AML。盡管這些細胞只占AML細胞的0.2%，但它們是唯一能在NOD/SCID小鼠體內形成移植瘤的細胞，故CD34+CD38-表型的細胞就被認為可能是LSC。Passegue等[3]進一步證實了CD34+CD38-Thy-1-的細胞是LSC。正常造血干細胞的表型則為CD34+CD38-Thy-1+，兩者非常相似。所以，LSC可能來源于的Thy-1-祖細胞，或者是喪失了Thy-1+表達能力的干細胞。

1.2 實體瘤腫瘤干細胞

1.2.1 乳腺癌與腫瘤干細胞 Al-Hajj等[4]將人乳腺癌組織的細胞接種到NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪組織中，建立了可靠的人乳腺癌起始細胞(BrCa-IC)體內試驗模型，并初步用與乳腺癌細胞相關的表面分子CD44和CD22、乳腺/卵巢癌特異性標志(B38.1)及上皮細胞特異性抗原，鑒定了BrCa-IC即乳腺癌腫瘤干細胞，提出乳腺癌組織中表面分子為ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的細胞是乳腺癌CSC 。雖然這些細胞只占所有乳腺癌腫瘤細胞的2%，但是其重建腫瘤的能力卻是其它表型腫瘤細胞的50倍。在此次實驗中，研究者切除移植瘤后分離出ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的細胞移植于下一個小鼠體內，發現只需要200個該表型的細胞就能成瘤，反復移植發現ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的腫瘤細胞均能在下一個小鼠體內形成與原發瘤類似的腫瘤，產生的新腫瘤中不僅含有ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的腫瘤細胞，還有表型各異的其它腫瘤細胞。這一特征與干細胞能自我更新和產生表型各異的子代細胞的特征相似。

1.2.2 腦腫瘤與腫瘤干細胞 2002年，Ignatova等[5]報道了在人皮質神經膠質瘤中包含神經干細胞樣的細胞。2003年，Singh等[2]從不同類型的腦腫瘤中分離和鑒定出細胞表面標志為CD133+表型的一類細胞，發現只有這類腫瘤細胞能在體外培養中形成腫瘤球，并且能不斷增殖、自我更新、分化，更重要的是形成的腫瘤球中沒有分化成熟的神經細胞、星形膠質細胞的標志，而且CD133+的腦腫瘤細胞可在裸鼠體內形成腫瘤；而CD133-的腫瘤細胞則貼壁并喪失增殖和分化能力，在裸鼠體內也無致瘤能力。故他們將CD133+的腫瘤細胞命名為腦腫瘤干細胞(BTSC)。BTSC與正常神經干細胞有相似的細胞表面標志，占整個腫瘤細胞總數的3.5%～46.3%。Hemmati等[6]通過對小兒腦部腫瘤的研究也得到相似的結果，認為腫瘤來源的神經球可能就是CSC，該細胞移植到小鼠大腦后能增殖分化，并發現BTSC除表達CD133外，還表達Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸絲氨酸磷酸化酶等神經干細胞和其它干細胞的基因特征。

1.2.3 結直腸癌與腫瘤干細胞 2006年，Brien[7]等利用結腸癌患者的腫瘤新鮮樣本做成腫瘤細胞懸液，用CD133抗體標記后注入NOD/SCID小鼠體內，結果CD133+的細胞只需要500個即可以成瘤，而CD133-的細胞幾乎不能成瘤，未做標記的腫瘤細胞懸液需要最少1×105個才能100%成瘤，將CD133+的NOD/SCID小鼠的腫瘤細胞再次移植到新的NOD/SCID小鼠體內，結果相同。而且新形成的腫瘤與原來腫瘤的表型異質性相似。Ricci-Vitiani等[8]也完成了同樣的研究，他們認為占結直腸癌細胞總數約2.5%的CD133+細胞是結直腸癌細胞的起始細胞。最近，Dalerba等[9]又發現上皮細胞黏附分子、CD44、CD166可以作為鑒定結直腸癌干細胞的細胞表面標志。

2 SP細胞分離方法

目前還有一種不需細胞表面標志而分離CSC的方法——根據干細胞外排DNA結合染料Hoechst33342的生物學特性而應用流式細胞儀進行分選。

Hoechst33342是一種脂溶性的藍色熒光染料，可以穿透細胞膜與DNA結合，常用于細胞凋亡的檢測，也用于普通的細胞核染色或常規DNA染色，細胞染色后用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。1996年，Goodell等首次提出在Hoechst33342染色的骨髓細胞中存在著一群染色很淺的細胞群，通過紫外激發后用雙波長分別為450nm的藍色熒光和675nm的紅色熒光分析，其中有不到0.1%的細胞發出微弱的藍光和紅光，在流式二維分析點陣圖上，呈彗星狀分布在造血干/祖細胞主群的一側，因此被稱為側群(SP)細胞。該群細胞體積較小，大多處于G0～G1或S～G2M期，并且能表達干細胞的標志(Sca-1+Lin-/low)，在移植實驗中也表現出造血干細胞的特點。隨后的研究表明該細胞群廣泛分布于人以及恒河猴、豬、小鼠、大鼠等多種動物的骨髓、胎肝、臍血、外周血等造血組織和血液中[10-12]。除了造血系統和血液外，SP細胞存在于人和動物的許多重要器官，如肝、肺、脾、腎、腦、神經、骨骼肌、心肌、睪丸、皮膚、胰腺、小腸、氣管等，參與了相應組織的更新與再生、器官系統的自我重建以及成體干細胞的多器官可塑性[13-15]。

與此同時，研究者還對分離出的SP細胞的細胞特性進行了研究，發現其具有很多類似干細胞的特性。最早在Goodell等的致死量照射鼠的造血系統重建實驗中，就發現SP細胞的擴增倍數大約為1000倍，體現出干細胞長期增殖的特點。Benchaouir等[16]發現多數SP細胞是處于G0期的靜止細胞，用電鏡觀察其超微結構，可以發現細胞內大多是滑面內質網，缺少粗面內質網和核糖體，這些特征多與細胞的低代謝活性有關；進一步分析其基因表達情況，發現SP細胞的轉錄能力與NSP細胞相比大幅降低，細胞內與細胞周期停滯相關的基因表達上調，而與細胞周期運行相關的基因表達下調，符合干細胞的慢周期特征。此外，SP細胞還具有多向分化潛能，在體外誘導下可以分化為多種組織細胞類型。最初的研究表明，來源于骨髓的SP細胞具有很強的重建造血系統的能力。

綜上所述，目前已有越來越多的研究證明SP細胞廣泛存在于人和動物的多種成體組織、實體瘤及腫瘤細胞系中，并具有干細胞樣特征。因此對SP細胞的研究不僅有助于增加人們對干細胞各種特性的理解，而且也提供了一種從組織細胞或腫瘤細胞中分離純化和利用干細胞的策略，尤其是在干細胞表面標志物不明的情況下更是如此。

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