內質網應激與相關肺疾病

高楚楚 盧紅艷

內質網應激是細胞的一種重要自我防御機制，而強烈持久的內質網應激可導致細胞凋亡。肺泡Ⅱ型上皮細胞含有豐富的內質網，具有發生內質網應激的條件和基礎，許多肺部疾病如間質性肺疾病、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、高氧肺損傷等的發生均與內質網應激有關。內質網應激可能是研究肺部疾病發病機制和防治措施的新靶點。

一、內質網應激概述

內質網是分泌性蛋白折疊、修飾和鈣貯存的主要場所，它在維持細胞穩態中起關鍵作用。多種因素如氧化應激、熱休克、缺血、感染等作用于細胞后均可引起內質網的內穩態失衡，導致蛋白加工/運輸障礙以及鈣離子攝取/釋放障礙，從而引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS主要激活細胞內3條信號通路:即未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)、折疊蛋白超負荷反應和固醇調節級聯反應。其中UPR是目前研究最為深入的ERS激活通路。哺乳動物細胞內有3種感受ERS的UPR信號元件，分別是PKR樣ER調節激酶(PERK)、Ⅰ型內質網跨膜蛋白激酶(IRE1)及活化轉錄因子6(ATF6)。在非應激狀態，內質網內的伴侶分子GRP78/Bip與 3者結合封閉其信號;應激時，GRP78/Bip從3種感受器元件上解離并與錯折疊蛋白結合阻止其輸出，導致3種感受器游離激活啟動UPR。PERK激活使真核細胞翻譯起始因子2(eIF2α)磷酸化失活，使之無法進行翻譯起始，從而抑制大多數蛋白質的翻譯生成，阻止新生蛋白持續進入內質網。另一方面，磷酸化eIF2α可增加ATF4轉錄合成，ERS過度激活時，ATF4高表達將導致凋亡信號分子CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer－binding protein homologous protein，CHOP)表達上調，誘導細胞凋亡。IRE1活化后剪切X盒結合蛋白1(XBP1)前體mRNA使之翻譯出活性XBP1，進而激活內質網應激反應元件(ER strss response element，ERSE)，上調分子伴侶轉錄水平，促進蛋白質正確折疊，同時促進未折疊蛋白轉運至胞質內進行內質網相關蛋白降解過程［1］。IRE1通路過度激活同樣能引起細胞凋亡，一方面，通過TRAF2－ASK1－JNK途徑激活JNK，誘導細胞凋亡;另一方面，直接或間接激活凋亡因子caspase－12，并進一步級聯激活caspase－9及 caspase－3，從而誘導細胞凋亡［2］。ATF6 與GRP78/Bip解離后轉移至高爾基體，被鞘氨醇－1－磷酸(S1P)和鞘氨醇－2－磷酸(S2P)切割激活后進入細胞核啟動ERSE基因表達。此外，ATF6還能與IRE－1共同作用誘導XBP1mRNA的增加，共同增強蛋白質折疊和相關蛋白降解能力［3］。ATF6過表達亦會誘導CHOP大量轉錄激活，引起細胞凋亡。

二、肺泡上皮細胞ERS的生物學效應

1．ERS與肺泡上皮細胞凋亡:肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells，AECs)的一個重要特征就是富含高度發達的內質網，以合成分泌大量肺泡表面活性蛋白(surfactant proteins，SPs)，對 ERS極為敏感。眾多研究表明，ERS過強過久，可通過激活下游相關信號轉導通路，導致AECS發生凋亡。應激條件下，內質網內Ca2+向胞質釋放，激活鈣蛋白酶，進而活化caspase家族，產生caspase級鏈反應。caspase－3是執行凋亡過程的最終效應子，它的活化可直接導致細胞凋亡發生，因此caspase－3的激活可作為鑒別AECs凋亡發生的一個重要標志。Xu等［4］發現，新生鼠高氧暴露后，AECs中BiP/GRP78和caspase－3表達顯著升高，提示ERS參與并介導AECs凋亡。ERS時，ATF4高表達可導致CHOP表達上調，而高表達的CHOP可通過下調抗凋亡基因Bcl－2的表達，減少細胞內谷胱甘肽量及增加活性氧產物而阻滯細胞分裂周期誘導細胞凋亡。Mulugeta等［5，6］研究發現，BiP/GRP78、ATF－4、CHOP等 ERS相關信號蛋白表達增高，參與AECs凋亡發生過程，同時認為caspase－4(人類的caspase－4和嚙齒類動物的caspase－12同源性最高)起了中介信號的作用激活caspase－3，最終誘導細胞凋亡。另外，JNK通過活化Bim(Bcl－2家族中的促凋亡因子)，抑制抗凋亡蛋白Bcl－2，從而介導線粒體途徑的細胞凋亡。胡蘭等［7］在高氧誘導的肺應激性損傷研究中發現，JNK信號轉導通路參與了高氧下AECs凋亡的信號轉導，發揮促細胞凋亡效應;阻斷或抑制JNK信號通路，可改善肺組織病理損傷，減少AECs凋亡。

2．ERS與肺泡上皮細胞上皮－間質轉化:上皮細胞—間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)是指完全分化的上皮細胞通過細胞表型改變從而轉化成完全分化的間質細胞的過程，通常轉化為成纖維細胞與肌纖維母細胞［8］。哺乳動物AECs主要由肺泡Ⅰ型上皮細胞(AECⅠ)和肺泡AECⅡ型上皮細胞(AECⅡ)組成，共同維持細胞的正常結構。其中AECⅡ是肺內主要干細胞，生理條件下，既可通過有絲分裂自我更新，也可轉分化為AECⅠ參與肺損傷后的早期修復過程;慢性肺損傷時，在致病因素持續作用下，AECⅡ不斷增殖并且向AECI轉分化失去調控，進而引起細胞過度增殖肥大，產生細胞因子、炎癥趨化因子、細胞黏附分子等，與此同時，該過程也可伴隨脂成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉分化，進一步誘導形成肺纖維化［9］。AECⅡ具有驚人的表型可塑性，在某些特定條件下(例如:損傷)，AECⅡ向AECⅠ轉化受抑，AECⅡ也可通過EMT過程轉變成成纖維細胞和肌纖維母細胞［10］。

目前，對于肺泡上皮細胞－間質轉化的機制尚未明確。有實驗發現TGF－β1能在體外誘導AECs向間質細胞轉變，其機制部分與Smad信號轉導途徑相關［11］。近來，Tanjore等［12］用衣霉素和變異的 SP －C誘導AECs發生ERS，顯示上皮細胞標志物E鈣黏蛋白、ZO－1等表達量降低，而間質標志物α平滑肌肌動蛋白(α－SMA)等表達量升高，同時通過siRNA轉染使Smad2與 Src激酶基因沉默抑制 EMT，發現AECs保留其上皮表型及上皮細胞標志，認為Smad和Src激酶可能是介導ERS時EMT的信號蛋白。Zong等［13］用肺上皮 A549細胞轉染突變體 SPCΔexon4誘導肺纖維化模型，發現ERS標志物GPP78表達升高，也發現類似的EMT標志物表達量變化，認為ERS誘導了AECs發生 EMT，并提示肺纖維化時，ERS對成纖維細胞增多起重要作用，且至少有Src依賴的信號途徑參與了該過程。

3．ERS與肺泡上皮細胞前炎癥信號:越來越多的證據表明ERS與炎癥反應存在密切聯系，目前認為其分子基礎主要涉及兩種機制，即核轉錄因子NF－κB和活化細胞內蛋白激酶JNK的激活。ERS時，活化的IRE1可募集腫瘤壞死因子受體相關因子2(TRAF2)形成IRE1－TRAF2復合體，一方面可進一步結合并激活JNK，進而磷酸化激活轉錄因子激活蛋白1(activator protein 1，AP1)，誘導前炎癥因子的基因表達［14］;另一方面可招募IκB并使其降解釋放出NF－κB，NF－κB離開膜表面進入細胞核內直接調控細胞活動，可誘導 TNF－α等炎性介質釋放［15］。PERK通路激活也可導致NF－κB的活化，由于IκB的半衰期顯著小于 NF－κB，ERS活化的 PERK－eIF2α介導的翻譯抑制作用增加了NF－κB/IκB的比值，釋放了“多余”的NF－κB入核，從而啟動前炎癥因子的基因轉錄［16］。內質網蛋白質折疊負荷超過自身處理能力時，發生ERS引起UPR，由各信號通路直接啟動炎癥反應。Maguire等發現，通過肺上皮A549細胞轉染SP－C突變體可引起多種UPR相關基因表達上調，活化JNK/AP－1信號，并增加IL－8等前炎癥細胞因子的分泌，說明SP－C突變后錯折疊可誘導ERS促進上皮細胞前炎癥信號。

三、ERS相關肺疾病

1．間質性肺疾病:間質性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是一組表現為不同程度的肺泡炎和間質發生纖維化病變的肺功能紊亂疾病，包括特發性肺纖維化(IPF)、間質性肺炎等。研究提示ERS可能在肺纖維化時肺組織上皮修復機制中起關鍵作用。Horowitz等發現，IPF患者肺勻漿和AECs中的ERS介導者ATF－6、ATF－4等以及凋亡介導者CHOP的蛋白水平、活化的XBP－1轉錄水平明顯增高，并在肺中檢測到CHOP下游的應激關鍵促凋亡分子Bax低聚物和應激凋亡標志物caspase－3的活性剪切體的存在。因此，在散發的IPF患者的AECⅡ中，嚴重的ERS反應可能是該細胞類型發生凋亡和纖維化的基礎。進一步研究提示SP－B和SP－C缺陷與ILD的發生發展關系密切，兒童及成人ILD患者的發病多數與SP－C編碼基因發生突變有關，SP－CΔexon4點突變進而引起SP－C錯折疊蛋白蓄積于內質網可啟動ERS級聯反應，激活 UPR，同時應激凋亡標志物caspase－12和caspase－4表達增加。

2．慢性阻塞性肺疾病:慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)的發病機制尚未明確，目前公認吸煙是COPD最重要的致病因素。ERS誘導AECs凋亡機制可能參與了COPD發病的病理生理過程。香煙煙霧中的氧化性物質可引起肺細胞發生ERS，過度ERS則誘導肺細胞發生凋亡，從而促進COPD的發生發展。Kelsen等通過蛋白質組學研究發現慢性吸煙者肺內GRP78、鈣網織蛋白、蛋白質二硫鍵異構酶等ERS及UPR相關標志蛋白表達上調，提示COPD患者肺內確實存在ERS。Tagawa等發現吸煙可引起小鼠肺內Bip和CHOP表達上調，認為存在ERS相關細胞凋亡。在吸煙誘導的COPD大鼠模型，肺泡上皮細胞內質網應激相關蛋白GRP78及凋亡基因caspase－12表達增加，提示吸煙誘導的COPD中，肺泡上皮細胞發生了內質網應激誘導性凋亡。這些結果提示ERS確實能影響COPD的發生發展。

3．肺癌:ERS可能在肺癌發生發展過程中起關鍵作用，Kim等發現ERS標志蛋白GRP78、CHOP和自體吞噬蛋白Beclin－1在肺癌中的激活現象與臨床病理因素以及患者存活情況有關，鑒于GRP78、CHOP和Beclin－1可能在肺部腫瘤發生發展過程中起重要作用，認為這些蛋白可成為非小細胞型肺癌患者病情轉歸的一項新預后指標。Dehydrocostuslactone(DHE)是一種倍半萜烯內酯，它可通過ERS介導的細胞凋亡對非小細胞型肺癌發揮抑制作用，這主要依賴DHE作用后可引起一系列ERS標志物的上調，包括胞質鈣水平的上調、IRE－1及CHOP/GADD153的增高、PERK的磷酸化、XBP－1 mRNA的拼接、caspase－4的激活等。對人肺癌A549細胞的研究證實asterosaponin 1同樣可使ERS經典標志物表達上調，包括 GRP78、GRP94、CHOP、caspase－4 和 JNK等，進而介導腫瘤細胞發生凋亡，這為肺癌治療提供新思路和相關依據。

4．高氧肺損傷:長期吸入高濃度氧可引起急慢性肺損傷，研究發現，氧化應激過程中產生的大量ROS是引起內質網中蛋白質錯折疊和ERS誘發凋亡的一個重要原因，提示持續性高氧暴露引起的氧化應激可導致ERS，導致肺損傷。肺損傷包括肺泡結構破壞、通透性增高及纖維化病變，由于AECⅡ是肺損傷時的關鍵修復細胞，ERS介導的AECⅡ存活及凋亡變化可能參與高氧肺損傷的發展和轉歸。Jennifer等發現高氧導致ERS引起細胞凋亡并不依賴于BiP，但能夠使細胞對錯折疊蛋白的毒性敏感，并產生大量ROS，該過程可增強UPR，說明高氧在肺疾病治療中引起肺損傷的過程可能與ERS相關。雖然諸多實驗表明高氧并不激活UPR感受器IRE1、PERK、ATF6，但肺損傷的發生與ERS誘導細胞凋亡通路密切相關。Xu等研究發現ERp57的過表達促進AECs凋亡，而敲除ERp57則可通過抑制caspase－3通路及上調BiP/GRP78表達從而減少高氧暴露引起的細胞凋亡。有研究發現在高氧誘導的肺損傷中，JNK信號轉導通路被激活，并參與了高氧下AECⅡ凋亡的信號轉導，發揮促炎癥和細胞凋亡效應;阻斷或抑制JNK信號通路，可減少高氧暴露下肺組織的炎性滲出及AECⅡ凋亡，對高氧肺損傷可能起保護作用［7］。支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia，BPD)是發生于早產兒長期應用高濃度氧和機械通氣后的一種以肺部出現炎癥和纖維化為主要特征的慢性肺損傷疾病，因此闡明ERS與高氧肺損傷的關系，可能對防治BPD發生具有重要指導意義。

四、ERS與肺部疾病治療

由于ERS參與了一系列肺部相關疾病的發生發展過程，以ERS為靶向的藥物研發具有廣闊的應用前景。通過藥物如牛磺酸、丹芍化纖膠囊等下調ERS發生標志物如GRP78、XBP－1、ATF4及ERS相關凋亡蛋白家族成員CHOP、JNK、Bcl－2等基因的表達，可減輕ERS反應并調控細胞凋亡，抑制肺部炎癥及肺纖維化，減輕肺損傷。干擾UPR激活或改變內質網伴侶蛋白GRP78/Bip表達水平，可阻遏在體腫瘤生長，為肺癌的治療提供新思路，例如asterosaponin 1可通過上調ERS標志分子GRP78、CHOP、caspase－4和JNK的表達從而發揮對肺癌A549細胞增殖的抑制作用，提示其可能會成為治療肺癌的一種新型藥物。另外，ERS的發生與錯折疊蛋白的聚集密切相關，暗示通過合理應用蛋白酶體激動劑有利于促進AECs內錯折疊蛋白SP－C的降解，減少其分泌合成，有可能成為治療肺部疾病的一個潛在途徑。

五、展 望

隨著實驗的深入，ERS與阿爾茨海默病、糖尿病、心血管疾病等發病機制的關系已日漸明朗，但現今對ERS參與肺部疾病病理生理過程的研究仍非常少。目前認為，ERS作為一把雙刃劍，可介導AECs的適應性存活與凋亡，對肺部疾病的發生發展起重要作用，但其具體機制尚未闡明，這些空白將吸引更多的科研人員致力于該領域的研究，為相關肺疾病的臨床治療提供科學依據。如探討SP－C異常與ERS發生的關系，研究SP－C突變后錯折疊對AECs增殖、分化及凋亡的影響，并從UPR及影響UPS活性角度闡明其損傷機制，都將進一步深化對相關肺疾病發病分子機制的認識并為其治療提供明確的分子靶標。

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