電阻抗法血小板計數的影響因素及對策

孫 克(綜述)，王 威(審校)

(1.解放軍252醫院檢驗科，河北 保定071000;2.保定市第一中心醫院檢驗科，河北 保定071000)

血小板是由巨核細胞脫顆粒產生的無核，但具有酶和生理活性的細胞，在生理性止血和某些病理過程中發揮著重要作用。近年來，臨床上需要輸注血小板的患者日益增多，但是輸注血小板價格高，且存在免疫學輸血反應和感染的風險。為此，國際上一再降低血小板的輸注起點，由過去的20×109/L降至10×109/L，甚至5×109/L。鑒于此，臨床迫切需要檢驗科提供一個準確的血小板計數結果，但是準確計數血小板并非易事［1］。現就目前臨床上最為常用的血小板計數方法［2-3］，即電阻抗法的原理、影響因素及對策進行簡要綜述。

1 電阻抗法血小板計數原理

將等滲電解質溶液稀釋的細胞懸液倒入不導電的容器中，將小孔管插入細胞懸液中，接通電流，小孔兩側產生穩定的電流。懸液中的細胞通過小孔時，根據細胞非導電的性質，會引起瞬間電壓的變化，產生一個脈沖信號。脈沖的振幅取決于細胞的體積，脈沖的數目取決于細胞的數目。血小板與紅細胞在同一系統進行檢測，根據紅細胞與血小板體積差異，儀器設定閾值，高于閾值為紅細胞，低于閾值為血小板，由此得出血小板數目。為了使血小板計數更加準確，不少公司又發明了一些專利計數。

1.1 擬合曲線 血細胞分析儀在進行血小板計數時只收集2～20 fl的原始數據，然后通過對數正態分布的擬合方法，計算出0～2 fl和20～70 fl的血小板數量。擬合曲線計數的使用，使血細胞分析儀在收集原始數據時，不收集0～2 fl的數據，可排除實驗室信號噪聲的干擾，不收集20～70 fl的數據可排除小紅細胞和紅細胞碎片的干擾。

1.2 浮動界標 儀器測定血小板時，以細胞體積大小作為劃分血小板的依據。由于血小板與紅細胞在同一系統進行檢測，為排除小紅細胞和大血小板的干擾，儀器使用浮動界標。浮動界標就是儀器使用上和下兩條辨別線或者上辨別線、固定辨別線和下辨別線;下辨別線的范圍一般在2～6 fl，上辨別線的范圍在20～35 fl，固定辨別線在12 fl。在計數血小板時，儀器自動移動上、下辨別線，以便有效檢查血小板計數。此方法可以很好地處理過多的小紅細胞和紅細胞碎片對血小板計數的干擾［4］。

2 血小板計數的影響因素

2.1 采血因素 采血因素是造成血小板計數結果偏低的主要因素，手指采血時如采血速度慢、出血不暢、擠壓采血部位等，都會造成假性血小板減少。靜脈采血時，多次穿刺會引起組織水腫及皮下出血，組織損傷造成血小板聚集、消耗，組織凝血因子混入血標本，產生肉眼看不見的小凝塊，使血小板計數結果偏低［5］。同時有學者作過統計［6］，即使技術熟練者順利采集的血液標本，靜脈血和末梢血的血小板計數結果亦存在差異。國內專家就血液分析儀血樣采集提出要求:除了嬰兒及少數無法取得靜脈血的患者外，其余患者均需采集靜脈血加抗凝劑，盡量避免用皮膚穿刺采取外周血［7］。

2.2 小紅細胞及巨大血小板的影響 使用電阻抗法進行血小板計數，紅細胞和血小板在同一系統內進行檢測，正常情況下，血細胞計數儀對細胞體積的識別有明顯的體積界限。但是，一些特殊標本，如小紅細胞、細胞碎片、巨大血小板則會對血小板計數結果產生干擾。對于紅細胞平均體積(mean corpuscular volum MCV)＜70 fl的血液標本，盡管儀器具有浮動界標和擬合曲線的功能，一些大小近似血小板的小紅細胞，仍會被當作血小板加以計數［8］。且MCV越小，小紅細胞數量越多，影響就越大。當出現大血小板和巨大血小板時，儀器會將其計數為紅細胞，導致結果偏低［9］。

2.3 抗凝劑EDTA的影響 國際血液學標準化委員會推薦，1.5～2.2 mg的乙二胺四乙酸二鉀鹽(ethylenediaminete traacetic acid K2，EDTA-K2)抗凝 1 mL的全血可以抑制血小板聚集，從而達到抗凝的目的。但是有少數人使用EDTA做抗凝劑時，卻會出現血小板聚集的現象，從而導致血液分析儀不能正常計數［10］，稱為EDTA依賴的血小板假性減少癥。其發生機制尚不明確，可能與纖維蛋白受體和糖蛋白有關［11］。多伴發于某種嚴重疾病，如膿毒血癥、癌癥、自身免疫性疾病、傳染性單核細胞增多癥等，也可見于一些門診健康體檢者和剛出生的嬰幼兒。另外，血液和抗凝劑比例也會影響檢測質量。血液比例過高時，由于抗凝劑相對不足，血漿中出現微血塊的可能性增加從而導致計數結果偏低?？鼓齽┑臐舛仍龈?，血小板會腫脹、崩解，產生正常血小板大小的碎片從而無法得出正確的結果。

2.4 其他因素 在實際工作中，標本放置時間［12］、試劑質量［13］、血小板冷凝集以及異常蛋白血癥等都可影響血小板的正常計數。

3 對策

3.1 重視血小板直方圖的觀察 電阻抗法血液分析儀在進行血液分析時，除給出細胞數外，還給出細胞體積分布的直方圖。血小板直方圖作為分析后質量控制的重要步驟，可以反映血小板計數的干擾因素。

3.1.1 正常的血小板直方圖 血細胞分析儀通常檢測血小板體積分布在2～30 fl范圍內的血小板，直方圖上正常血小板主要集中在2～20 fl，呈左偏態分布。在20～30 fl(隨儀器型號而定)直方圖曲線逐漸接近橫坐標或與之重合［14］。

3.1.2 大血小板增多的血小板直方圖 與正常的血小板直方圖相比，曲線峰右側右移，特別是與橫坐標接近點或重合點明顯右移，同時血小板平均體積增高，一般＞12 fl，在白細胞直方圖35 fl處，常可見一個小高峰［14］。同時，MCV和紅細胞分布寬度正常，可以排除小紅細胞的干擾。

3.1.3 血小板聚集干擾的血小板直方圖 與正常的血小板直方圖相比，曲線分布峰明顯右移且左側起點較高，不與橫坐標重合，MPV值增高，血小板計數值通常明顯減低，儀器一般不顯示血小板其他參數［15］。

3.1.4 小紅細胞或紅細胞碎片干擾的血小板立方圖 與正常的血小板直方圖相比，直方圖曲線光滑，峰高位置均正常，右側尾部接近橫坐標但未與橫坐標重合，而是與橫坐標平行延伸后抬高，欲形成另外一個峰［16］。抬高起始位置＞25 fl。同時紅細胞直方圖波峰明顯左移，起始部位抬高，MCV通常＜70 fl，血小板計數值假性升高［17］。

3.2 光學法進行復檢 使用電阻抗法進行血小板計數，對于正常血液標本來說，具有經濟、快速、重復性好等優點。由于其方法學的局限性，當出現血小板直方圖的異常時，必須使用其他方法進行復檢。光學法采用的是半導體流式細胞檢測原理，對每個血小板從高低角度二維激光掃描，即用前向散射光檢測血小板體積，由熒光強度提供RNA信息進行內部結構的確認和計數［18］。目前，多數學者［19-21］認為，當血液標本中存在大血小板、血小板凝集、紅細胞或紅細胞碎片以及低值血小板時，使用光學法進行血小板計數可以獲得準確的結果。

3.3 手工法復檢 對于血小板直方圖異常的血液標本，可以令有經驗的工作人員使用國際衛生組織推薦的草酸銨法進行目視顯微鏡計數。但是該法計數血小板較少，重復性差。有學者報道，該法在不同操作者間的變異系數可達10%～25%。劉善鳳等［22］通過制備血涂片在油鏡觀察，不僅能發現血涂片中血小板的數量分布情況，還能觀察血小板和紅細胞是否存在形態學病理改變，并通過計數白細胞和血小板的比值間接計數血小板的數量。對電阻抗法血小板計數，可以起到很好的補充作用，對及早發現和初步糾正血小板假性減低有明顯意義。具體方法［23］如下:在血片體尾交界區，采用城垛式計數方法無重復計數100個血小板(N目測血小板數)和涉及視野中所有的白細胞數(N目測白細胞數)，對于血小板嚴重減少的患者，計數不少于50個血小板;以儀器計數的白細胞數(N儀器×109)作為參考，血小板數量 N=(N目測血小板數/N目測白細胞數)N儀器×109/L。

綜上所述，隨著科學技術的飛速發展，電阻抗法的血液分析儀已廣泛應用于臨床檢驗工作中，極大地提高了檢驗人員的工作效率和工作質量。由于其方法學的局限性，易受到各種干擾因素的影響，所以熟知其工作原理及各種影響因素，并能夠通過血小板直方圖及其相關參數判斷干擾因素的形成原因對于血小板計數的準確性至關重要。對異常的血液標本宜通過光學法或手工法進行糾正，以保證為臨床診斷、治療工作提供可靠的信息資料。

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