酶洗法制備兔組織工程氣管支架的周期研究

李建忠 張志培 汪健 吳凡 金巖 韓勇 姜濤 閆小龍 倪云峰 趙晉波 李小飛

組織工程同種異體氣管移植是當前氣管外科領域研究的重點。已有報道用酶洗法制備豬氣管支架，但實驗尚存在諸多不確定因素[1]，國內外尚未有用酶洗法制備兔氣管支架研究的相關報道。本實驗探討酶洗法制備兔氣管支架的適宜周期，為研究組織工程同種異體氣管移植提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

脫氧膽酸鈉（北京奧博星生物技術有限責任公司），脫氧核糖核酸酶-Ⅰ（DNase-Ⅰ）（Roche公司，德國），兩性霉素 B(Amresco公司，美國)，青霉素（哈藥集團制藥總廠），蔡司正置顯微鏡Axioskop 40（ZEISS公司，德國），鎢燈絲掃描電鏡VEGA3 LMH（Tescan公司，捷克），電子實驗機（Shimadzu公司，日本）。

1.2 實驗動物與分組

健康新西蘭兔24只，體質量2.5～3.0 Kg，雌雄不限，購自第四軍醫大學實驗動物中心。隨機等分為4 組（n=6）。A 組，對照組，新鮮氣管；B、C、D 組，實驗組，氣管分別經過2、3、4個周期的處理。

1.3 氣管支架制備方法

耳緣靜脈空氣栓塞致死，無菌條件下取出氣管，迅速剝離氣管上的疏松結締組織。經含有1%青霉素、1%兩性霉素B的PBS緩沖液沖洗3～4min后，A組氣管浸泡在4℃的PBS緩沖液中準備檢測；B、C、D組氣管沖洗后均置入4℃純凈水中浸泡48 h。取出后在含有4%脫氧膽酸鈉生理鹽水中浸泡3 h，PBS沖洗3～4min。然后在含有2000 KU/LDNase-Ⅰ的生理鹽水中浸泡3 h，B、C、D組分別如此循環2、3、4個周期，處理好的標本浸泡在4℃的PBS溶液中準備檢測。

1.4 檢測方法

將處理后的氣管參照 Macchiarini［2］生物力學檢測標準進行完整氣管力學檢測；取長約0.5 cm氣管環于中性福爾馬林固定24h，行脫水、浸蠟、包埋、切片處理后，HE染色后組織學觀察；取長約1.5 cm氣管環以戊二醛固定后，掃描電鏡超微結構觀察。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 生物力學檢測

生物力學檢測顯示：各組氣管長度均數不相等，差異無統計學意義(P>0.05)。組間兩兩比較顯示，D組最大拉伸力、破裂力、變異率均小于A組、B組、C組，差異顯著（P＜0.05）；而 A 組、B 組、C 組兩兩比較，差異沒有統計學意義（P>0.05）。（表1）

表1 氣管支架生物力學比較Table 1.Comparison of biomechanics on trachea among 4 groups（）

表1 氣管支架生物力學比較Table 1.Comparison of biomechanics on trachea among 4 groups（）

變異率（%）對照組 A 5.02±0.604.465±0.65 0.645±0.072 9.64±0.48 202±8實驗組 B 4.98±0.574.425±0.55 0.535±0.082 9.48±0.50 198±10實驗組 C 4.96±0.584.375±0.45 0.525±0.064 9.58±0.52 197±9實驗組 D 5.10±0.612.855±0.30*0.350±0.042*9.86±0.46142±18*組 別 氣管長度（cm）最大拉伸力（N） 破裂力(N) 破裂點（cm）

2.2 組織學觀察

HE染色顯示：A組氣管黏膜上皮組織可見大量完整的黏膜上皮細胞；B組氣管黏膜上皮組織見部分完整黏膜上皮細胞；C組、D組氣管黏膜上皮細胞未見完整的黏膜上皮細胞（圖1）。

圖1 組織學觀察（HE，400×）Fig.1 Histological observation of tracheas(HE,400×)

2.3 掃描電鏡觀察

掃描電鏡顯示A、B、C組的氣管支架膠原纖維間有殘存的細胞基質，膠原纖維較粗；D組的氣管支架未見細胞基質，膠原纖維較細（圖2）。

圖2 掃描電鏡觀察：（SEM，3000×）Fig.2 Ultrastructure observation by SEM(SEM,3000×)

3 討論

全球首例組織工程同種異體左主支氣管成功移植［3］后，組織工程同種異體氣管移植已成為氣管重建領域的研究熱點，但尚未有組織工程同種異體氣管移植的相關報道。氣管支架的構建和再細胞化是構建組織工程同種異體氣管的主要制約因素。氣管支架既需有理想的去抗原效果、生物力學性能，又需最大限度地保持細胞外基質的完整性，以達到支架支撐效果，并有助于同種異體成軟管細胞和氣管黏膜上皮細胞的再細胞化。

在深低溫冷凍法［4-5］、玻璃化液冷凍法［6-7］及酶洗法［1-3］三種主要制備氣管支架的方法中，酶洗法越來越受到關注。本研究采用酶洗法分別處理3個實驗組2、3、4個周期，制備氣管支架，并與未處理氣管進行比較。生物力學結果比較顯示，處理3個周期的氣管支架的最大拉伸力、破裂力和變異率顯著大于處理4個周期的氣管支架。實驗證明處理周期太短則有完整的黏膜上皮細胞殘存，不能有效去除氣管的抗原性，處理周期太長則損壞細胞外基質，影響氣管支架的再細胞化。綜上所述，采用4%脫氧膽酸鈉及2000 KU/L DNase-Ⅰ處理兔氣管3個周期，既具有理想的去抗原效果、生物學性能，又最大限度地保持了細胞外基質的完整性，適于構建兔組織工程同種異體氣管。

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