注射用水飛薊賓葡甲胺鹽在大鼠體內藥動學及組織分布的研究

李秋紅，楊柳，吳瑩，葛越，李天英

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

水飛薊賓(silibinin)來源于菊科植物水飛薊(Silybum marianum)果實，為黃酮木脂素類化合物，具有明顯抗氧化、抗炎、保護肝細胞、促進肝細胞再生的作用，臨床上作為保肝藥物長期應用［1－2］。在臨床上主要應用片劑、膠囊劑，但其具有難溶性，且生物利用度低，吸收不穩定，從而影響臨床療效，故近年來提高水飛薊賓生物利用度的制劑研究較多［3］，不斷有新的劑型推出［4－6］。水飛薊賓葡甲胺鹽凍干粉末作為水飛薊賓注射劑處于研制階段［7］，做為注射劑使用可以提高其生物利用度。

水飛薊賓葡甲胺鹽作為注射劑在犬體內有研究［8］，但其藥物動力學研究尚未見報道。本文針對靜脈注射水飛薊賓葡甲胺鹽后大鼠體內的藥動學過程及其在組織中的分布進行研究，為水飛薊賓葡甲胺鹽注射劑的進一步研究提供參考依據。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(LC－2010，日本島津，UV檢測器，Class－vp色譜工作站);氮吹儀(KL512型，北京);旋渦混合器(XW－80A，上海);高速冷凍離心機(TGL16M，長沙);超濾離心管(Millipore，美國);水飛薊賓對照品(常州龍騰生物科技有限公司，批號20051103);水飛薊賓葡甲胺鹽(常州龍騰生物科技有限公司，批號20030201);其它試劑均為市售色譜純、分析純;水為超純水。

1．2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil(R)C18柱(250mm ×4.6mm，北京迪馬公司)，流動相:乙腈:0.3%磷酸水(47∶53，v:v)，流速:0.8mL/min，柱溫:30℃，檢測波長:288nm。

1．3 動物實驗

清潔級雄性 Wistar大鼠，12～14周齡，體質量370～420g(由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，SYXK(黑)2008－001提供)。大鼠麻醉后，施行靜脈插管，快速靜脈注射水飛薊賓葡甲胺鹽注射液(按照人體高、中、低劑量等效量折算相應劑量為6．25、12.5、25mg/kg，由于水飛薊賓葡甲胺鹽注射劑并未在臨床上應用，無市售。故使用前需配制)，給藥后于3、5、10、20、30、40、60、80、100、120min 采集血液樣品200μL，立即離心分離得血漿。整個實驗過程中，用電熱毯保持大鼠體溫，直至實驗結束。另取鼠，在高劑量給藥后，分別于 30、60、90、120、180、240min 斷頭處死動物，取心、肝、脾、肺、腎，剔除結締組織，稱重。

1．4 標準溶液的配制

精密稱取水飛薊賓葡甲胺鹽對照品，加甲醇溶解，配制成1.0mg/mL標準儲備液，于－20℃下保存待用。臨用時以甲醇為溶劑逐級稀釋，得到所需濃度的標準溶液。

1．5 樣品的處理

1．5．1 血漿樣品的處理

精密移取各個采集時間點的含藥血漿100μL，向每只試管中加入叔丁基甲醚1mL，渦旋混合1min，離心10min(3000r/min)，取上清液0.7mL，50℃水浴下氮氣吹干，用200μL的流動相溶解混合，取20μL進樣分析。

另取500μL血漿樣品置于超濾離心管中，冷凍離心40min(10000r/min)，取濾液，加入甲醇1mL后按上述方法進行操作，進樣20μL，HPLC分析。

1．5．2 組織樣品處理

取大鼠心、肝、脾、肺、腎稱量約0.5g，剪碎，加入1mL生理鹽水，用勻漿機以5000r/min制成均勻的組織勻漿。取上清液400μL，加入2mL叔丁基甲醚，渦旋混合5 min后，4000r/min離心10min。取上層液，40℃氮氣吹干，殘渣加200μL甲醇使其溶解，再次渦旋，冷凍離心10min后，取上清液20μL進樣分析。

1．6 數據分析

以測得血藥濃度繪制藥時曲線，根據AIC法判別隔室模型，血漿濃度(C)－時間(t)數據依下公式解析:

Cp=Ae－at+Be－βt，A、B、α 及 β 為混雜參數。

用藥動學軟件3P97程序進行主要藥動學參數A、B，α、β、AUC、CL、K10等的計算，用下列公式計算藥物與血漿的蛋白結合率。各實驗結果數據以(±s)表示。

2 結果

2．1 方法學考察結果

2．1．1 標準曲線的制備

精密加入水飛薊賓葡甲胺鹽標準溶液于100μL空白血漿及400μL組織勻漿中，配制濃度分別為10.0、50.0、100.0、300.0、500.0、700.0μg/mL 的血漿標準系列及濃度分別為 0.1，0.5，1，2，5，10μg/mL 的各組織標準系列，按樣品處理方法操作，在HPLC測定條件下，測水飛薊賓葡甲胺鹽峰面積，對峰面積的值(y)和濃度(x)進行回歸，得到水飛薊賓葡甲胺鹽標準曲線方程分別為:血漿 y=5364x－6080.6，r=0.9992;心 y=29501x+6407，r=0.9989;肝 y=29359x+7194.7，r=0.9998;脾 y=29259x+24820，r=0.9971;肺 y=28166x+5571.2，r=0.9992;腎 y=29028x+11746，r=0.9990。分別在10～700μg/mL濃度范圍內及0.1～10μg/mL濃度范圍內線性關系良好，最低定量限分別為10μg/mL及0.1μg/mL。

2．1．2 方法特異性考察

按照上述色譜條件和血樣處理方法，分別將空白血漿、樣品血漿和空白血漿加對照品經血樣處理步驟操作后進樣分析，所得色譜圖如圖1所示。

圖1 樣品色譜圖

由圖1可見，在上述色譜條件下，空白血漿中的內源性物質對水飛薊賓葡甲胺鹽的測定在出峰位置沒有干擾，因此本方法具有良好的專屬性。在各組織樣品中，水飛薊賓葡甲胺峰處無雜峰干擾，特異性好。

2．1．3 精密度和回收率實驗

精密移取一定體積的水飛薊賓葡甲胺鹽標準溶液于100μL空白血漿和組織勻漿中，配成低、中、高三個濃度(血漿濃度為 10，100，700μg/mL，組織濃度為0.1，1，10μg/mL)的血漿樣品和各組織樣品，按樣品處理方法進行處理，進樣分析，用當日標準曲線計算回收率。低、中、高三種濃度的血漿及組織樣品中方法回收率分別在97.94%～104.19%和91.23% ～105.91%之間，日內和日間精密度的RSD均小于10%。

2．1．4 穩定性考察

取低、中、高三個濃度的標準樣品，進行穩定性的考察。實驗結果表明，樣品處理流動相復溶及樣品放置在－20℃冷凍保存后反復融化、冷凍，穩定性均良好(RSD＜5%)。

2．2 藥動學結果

靜脈注射高、中、低劑量水飛薊賓葡甲胺鹽后，水飛薊賓葡甲胺鹽血藥濃度－時間曲線(見圖2);根據藥時曲線結果，經3P97軟件計算，得出主要藥動學參數(見表1)。

圖2 高、中、低劑量給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽血藥濃度－時間曲線

表1 水飛薊賓葡甲胺鹽表藥動學參數(n=5，±s)

表1 水飛薊賓葡甲胺鹽表藥動學參數(n=5，±s)

0．314 ±0．03 0．42 ±0．05 0．588 ±0．07 β(min－1)0．025 ±0．001 0．050 ±0．002 0．050 ±0．007 t1/2α(min)2．201 ±0．091 0．877 ±0．090 1．177 ±0．031 t1/2β(min)27．110 ±0．50013．829 ±0．21211．526 ±0．901 AUC(μg/mL/min)1868．671 ±25 1427．284 ±16 452．248 ±152 K10(min －1)0．018 ±0．01 0．0286 ±0．02 0．033 ±0．037 CL(mL/min)0．026 ±0．001 0．041 ±0．002 0．037 ±0．004 t1/2(min)ParametersHigh－doseMedium－doseLow－dose α(min－1)38．06103 ±0．524．14802 ±0．3 20．6409 ±0．8

通過中、低劑量給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽藥動學參數對比發現，AUC隨劑量增加而成比例增加，t1/2無顯著性差異，說明在此劑量范圍內水飛薊賓葡甲胺鹽的消除為線性消除;而高、中劑量給藥后AUC不成比例將使血藥濃度與之不成比例的升高或下降。t1/2顯著延長，表明水飛薊賓葡甲胺鹽在高劑量范圍內大鼠體內消除過程呈現非線性動力學特征，劑量微小變化。

2．3 血漿蛋白結合率測定結果

經超濾法測定高、中、低劑量靜脈注射給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽的蛋白結合率，結果分別為:高劑量:(70.53±0.01)%;中劑量:(72.02±0.02)%;低劑量:(73.43±0.01)%，測定結果不隨劑量的變化而變化(P＞0.05)。

2．4 組織分布結果

由實驗結果可知，高劑量的注射用水飛薊賓葡甲胺在大鼠體內的各個組織都有一定量的分布，在體內分布的最高濃度的大小順序為肺、肝、心、腎、脾。由實驗結果可以看出，注射用水飛薊賓葡甲胺鹽在各組織中的濃度在肺內的濃度較大，并且在60min附近藥物濃度達到最大值(1.46μg/mL);其次是肝臟，是在60min達到最高的藥物濃度。而腎臟與脾臟均是在90min達到藥物濃度最高點，心臟是在30min達到最高的藥物濃度。隨著時間的推移，各個組織器官中水飛薊賓葡甲胺鹽的含量迅速下降，到180min后，水飛薊賓葡甲胺鹽在各個組織器官的含量比較低，并且各個組織中水飛薊賓葡甲胺鹽含量沒有明顯的差別。

圖3 高劑量給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽組織分布曲線(n=5，±s)橫坐標為t/min，縱坐標為logC(μg/mL)

3 討論

3．1 由于水飛薊賓葡甲胺鹽其水溶性仍然很差，所以注射劑的制備過程中加入增溶劑［8］。本實驗嘗試使用了丙二醇、無水乙醇、PEG400來增加水飛薊賓葡甲胺鹽的水溶性。結果顯示，使用丙二醇的的增溶效果要好于無水乙醇、PEG400，所以本實驗應用丙二醇增溶。

3．2 高、中、低劑量下的AUC除以其相應劑量所得的比值(84.72、114.16、72.32)經數理統計t檢驗具有顯著差異(P＜0.05)，這表明注射用水飛薊賓葡甲胺鹽在大鼠體內的消除過程呈非線性動力學特點。非線性速度過程的產生，通常是由于藥物的體內過程有酶和載體的參與，或是藥物與血漿蛋白結合達飽和。本實驗中，高、中、低劑量下血漿蛋白結合率均在70%左右(是一種蛋白結合率非劑量依賴性藥物)，推斷非線性藥動學過程不是由結合蛋白飽和引起的，產生非線性藥動學過程的具體機制尚不明確，有待進一步研究。

3．3 由圖3可知，心臟、肝臟與肺臟的藥－時曲線比較尖銳，而脾臟與腎臟的藥時曲線比較平緩。以腎臟的藥時曲線可以看到，在60min和90min的藥物濃度比較接近，證明水飛薊賓葡甲胺鹽在腎臟的代謝是比較緩慢的。并且肝臟的藥－時曲線在180min時，出現一個比較小的藥物濃度峰，分析原因可能是肝中的某種代謝酶致使肝臟中代謝產物轉化所致，但具體機制有待進一步研究。由以上實驗結果可知，水飛薊賓葡甲胺鹽在肺臟中分布較多，在劑型研究過程中應考慮通過某些方式來改變其體內分布，使藥物在肝臟中有更多的分布，使藥物發揮更強大的藥理作用。

本實驗首次應用HPLC法來研究注射用水飛薊賓葡甲胺鹽在大鼠體內的藥動學過程，通過不同劑量給藥后藥動學參數的比較，明確水飛薊賓葡甲胺鹽在大鼠體內的藥動學過程。與以往的口服給藥相比較，靜脈注射給藥克服了其吸收差、生物利用度低的缺點，可見該劑型具有很大的研究價值及市場潛力。

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