內皮素-1 對牙周膜細胞白介素-6 表達的影響*

梁 莉 劉洪臣 鄂玲玲 王東勝

牙周炎是一種口腔常見的細菌感染性疾病，牙周致病菌是通過多種炎性因子和細胞毒性作用產生對牙周組織的破壞性影響，導致牙周組織中的RANKL/RANK/OPG調節系統失衡，最終造成牙周膜、牙槽骨破壞[1]。IL-6是一種多功能的細胞因子具有許多和牙周炎發病機制相關的活性。內皮素-1(endothelin-1，ET-1)作為一種縮血管肽具有多種功能，與各種細胞因子之間存在復雜的聯系，研究表明[2]，ET-1與牙周炎的發生有極為密切的關系而且參與了細胞因子的調節，但ET-1在牙周炎發病機制中的作用機理尚不清楚。因此，我們通過研究ET-1對牙周膜細胞IL-6表達的影響，為探討ET-1在牙周炎發病機制中的作用機理奠定基礎，進而為尋求治療牙周炎提供可能的途徑。

1.材料和方法

1.1主要試劑 內皮素-1(sigma，美國),DMEM培養基(Gibco，美國)，胎牛血清(FCS)(浙江金華清湖犢牛利用研究所)，胰蛋白酶(Gibco，美國)，DG-3022型酶聯免疫監測儀(南京華東電子儀器廠)。

1.2人牙周膜細胞的培養[3]選取11-13歲因正畸需要而拔除的前磨牙，無菌條件下刮取牙根中1／3的牙周膜組織，剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm小塊，平鋪于25m l培養瓶底，加入含10%FCS的DMEM 培養液，放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2、100%濕度條件下培養，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待細胞長至培養瓶底約80%時,即可按1∶2傳代。棄去原培養基,用PBS洗滌一次,加入0.25%胰蛋白酶及0.2%EDTA 2m l消化。相差顯微鏡下觀察,待大多數牙周膜細胞已收縮變圓且與瓶壁分離(約10m in)，加入含10%胎牛血清DMEM 終止反應。反復吹打后離心(800r/m in,5m in)。調整細胞密度，按4×105/瓶密度接種。取4-8代細胞進行實驗。

1.3 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白的影響 牙周膜細胞按1×105/孔的密度接種于六孔板，培養12h待其貼壁，換無血清DMEM培養基沉默過夜。加入不同濃度(1，10，100nM)的ET-1，以未作任何處理的牙周膜細胞為空白對照。為明確內皮素作用的特異性，培養基內加入ET-1(100nM)，內皮素受體ETA拮抗劑BQ123(100nM)和ETB拮抗劑BQ788(100nM)[4]作陰性對照。12h提取細胞培養上清液，按照ELISA試劑盒說明書的檢測方法進行操作，檢測細胞培養上清液中IL-6蛋白水平。

1.4 ET-1對牙周膜細胞IL-6m RNA表達的影響 收集上述各組細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA。本研究采用SYBRGreenⅠ嵌合熒光法對PCR擴增產物做實時定量評估。PCR擴增條件：95℃預變性10 m in；95℃15s，60℃1m in，72℃30s，40個循環；72℃8m in。Applied Biosystem 7500Softw arev 2.0軟件分析IL-6與內參GAPDH相對比值，以定量評估IL-6表達水平。合成Real-time PCR引物如下：

IL-6

上游引物：5′-TTGGGACTGATGTTGTTG AC-3′

下游引物：5′-GGCAAATTTCCTGGTTAT ATCC-3′

GAPDH

上游引物：5′-GGAAAGCTGTGGCGTGA T-3′

下游引物：5′-AAGGTGGAAGAATGGGAG TT-3′

1.5統計學處理 實驗數據用spssv 13.0統計軟件進行分析處理。數據以均數±標準誤(M ean±SEM)表示。應用ANOVA檢驗多個樣本均數間差異。設P<0.05為差異具有顯著性。

2.結果

2.1 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白的影響

ELLSA檢測結果顯示：ET-1(1，10，100nM)劑量依賴性地促進牙周膜細胞IL-6的分泌。與空白對照組相比，ET-1(1，10，100nM)對牙周膜細胞IL-6分泌具有顯著的促進作用(P<0.05)(表1，圖1)。但加入BQ123(100nM)和BQ788(100nM)后,牙周膜細胞IL-6表達水平與對照組沒有明顯差異(表1，圖2)。內皮素受體ETA拮抗劑BQ123和ETB拮抗劑BQ788可抑制ET-1對牙周膜細胞IL-6分泌的促進效應。

表1 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白的影響

圖1 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白表達的影響(*P<0.05)

圖2 ET受體拮抗劑對牙周膜細胞IL-6蛋白表達的影響(*P<0.05)

2.2 ET-1對牙周膜細胞IL-6m RNA表達的影響 實時定量PCR分析結果顯示：與空白對照組相比，ET-1(1nM)處理組牙周膜細胞IL-6m RNA表達無明顯改變，ET-1(10或100nM)處理組牙周膜細胞IL-6mRNA表達明顯增強(P<0.05)(表2，圖3)，ET-1(1，10或100nM)劑量依賴性地促進牙周膜細胞IL-6m RNA表達。而陰性對照組牙周膜細胞IL-6m RNA表達水平與對照組沒有明顯無差異(表2，圖4)，內皮素受體ETA拮抗劑BQ123和ETB拮抗劑BQ788可抑制ET-1對牙周膜細胞IL-6mRNA表達的促進效應。

表2 ET-1對牙周膜細胞IL-6mRNA表達的影響

圖3 ET-1對牙周膜細胞IL-6m RNA表達的影響(*P<0.05)

圖4 ET受體拮抗劑對牙周膜細胞IL-6mRNA表達的影響(*P<0.05)

3.討論

一般認為，牙周炎的組織損傷是牙周病原體及其代謝產物誘導的宿主免疫反應引起的，免疫細胞及局部組織細胞(如牙周膜細胞)分泌炎性因子參與這一過程。這些因子在牙周炎的發生和修復過程中也扮演著重要的角色。IL-6是一種多功能的細胞因子,具有許多和牙周炎發病機制相關的活性，在牙周炎癥造成的組織破壞過程中起局部調節作用，是炎癥反應和免疫應答中十分重要的調節因子[5]。

內皮素(endothelin，ET)是日本學者從豬的主動脈內皮細胞培養的上清液分離純化的一種血管活性肽，是迄今所知活性最強的血管收縮因子[6]，具有多種功能，與各種細胞因子之間存在復雜的聯系，在各種炎癥細胞中都有表達。研究發現，ET-1與牙周炎的發生有極為密切的關系[2]。在牙周炎病理過程中，ET-1在炎癥牙周組織和細胞中含量顯著升高，并參與了細胞因子網絡的調節。牙周炎致病菌與ET-1參與牙周炎癥有著密不可分的關系[7]?；蚨鄳B性分析也表明ET-1基因與成人牙周炎易感性可能存在一定的關系[8]。但內皮素-1在牙周炎發病機制中的作用機理尚不清楚。

在本研究中，我們從蛋白水平和基因水平證實，ET-1可以明顯地促進牙周膜細胞IL-6的表達，而且這種促進作用隨內皮素-1濃度的增高而逐漸明顯。但內皮素受體拮抗劑抑制了ET-1對牙周膜細胞IL-6分泌的促進效應，結果提示ET-1可能是通過上調牙周膜細胞IL-6的表達參與牙周炎的發病過程，通過抑制ET-1的作用可以下調IL-6引發的炎性反應，使用內皮素受體拮抗劑有望成為控制牙周炎的新途徑。

因此，本研究發現ET-1可以明顯地促進牙周膜細胞IL-6的表達，但內皮素受體拮抗劑抑制了ET-1對牙周膜細胞IL-6分泌的促進效應，這對進一步研究內皮素-1在牙周炎發病機制中的作用機理奠定了基礎，進而為尋求治療牙周炎提供可能的途徑。

[1] Teles FR,Teles RP,Martin L,et al.Relationships among interleuk in-6,tum or necrosis factor-α,adipokines,vitam in D,and ch ronic periodontitis.JPeriodontol，2012，83(9)：1183-1191

[2] Fujioka D,Nakamura S,Yoshino H,et al.Exp ression of endothelins and their receptors in cells from human p eriodontal tissues.JPeriodontalRes，2003，38(3)：269-275

[3] 梁 莉，劉洪臣，周 威，等.牙周膜成纖維細胞對成骨細胞細胞數量和堿磷酶活性的影響[J].中華老年口腔醫學雜志，2012，10(2)：72-74

[4] Rik imaru T,Aw ano S,M ineoka T,et al.Relationship betw een endothelin-1 and interleuk in-1beta in in flam ed periodontal tissues.Biom ed Res，2009，30(6)：349-355

[5] Teles FR,Teles RP,Martin L,et al.Relationships am ong interleuk in-6,tumor necrosis factor-α,adipokines,vitam in D,and ch ronic periodontitis.JPeriodontol，2012，83(9)：1183-1191

[6] Yanagisaw a M,Kurihara H,Kim ura S,Tomobe Y et al.A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascu lar endothelialcells.Nature，1988，332：411-415

[7] Lester SR,Bain JL,Serio FG,et al.Relationship betw een gingival angiopoietin-1 concentrationsand depth of the adjacent gingival su lcus.J Periodontol，2009，80(9)：1447-1453

[8] Beik ler T,PetersU,Prior K,et al.Geneexpression in periodontal tissues follow ing treatm ent.BMC Med Genom ics，2008，7(1)：30