轉(zhuǎn)錄因子GATA－1 與人巨細(xì)胞病毒UL111A 基因5'上游序列結(jié)合的實(shí)驗(yàn)研究*

田可港， 浮 苗， 高 艷， 彭 穎， 李 祥， 鄭曉群△， 徐志偉， 宋建華， 呂建新

(1溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心，浙江 溫州325027;2溫州醫(yī)學(xué)院浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州325035;3俄克拉荷馬醫(yī)學(xué)研究中心，美國(guó) 俄克拉荷馬73104)

人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是皰疹病毒科屬的DNA 病毒，具有嚴(yán)格的種屬特異性。1960 年，Weller 等鑒于病毒感染細(xì)胞后所呈現(xiàn)細(xì)胞明顯增大的特征及該病毒在巨細(xì)胞包涵體病中的作用，將該病毒命名為巨細(xì)胞病毒。1973 年，國(guó)際病毒命名委員會(huì)(ICNV)皰疹病毒組將此病毒正式命名為人類(lèi)皰疹病毒5 型(human herpes virus 5，HHV- 5)。在免疫正常個(gè)體，HCMV 的初發(fā)感染常無(wú)癥狀，當(dāng)宿主免疫功能不全或免疫功能減弱時(shí)，HCMV 的原發(fā)感染或潛伏再激活感染會(huì)引起嚴(yán)重的乃至威脅生命的疾病［1-2］。cmvIL - 10 是HCMV UL111A 基因編碼的由175 個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，功能與人IL -10(hIL -10)類(lèi)似。既往研究表明，HCMV 潛伏感染時(shí)，UL111A 基因不表達(dá)cmvIL -10，激活感染時(shí)表達(dá)cmvIL -10［3-6］。因此我們推測(cè)，cmvIL-10 可能參與HCMV 潛伏及再激活感染的過(guò)程。人轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 由413 個(gè)氨基酸組成，含2 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，即C -鋅指和N -鋅指，可通過(guò)與基因啟動(dòng)子中的(A/T)GATA(A/G)模序結(jié)合激活基因轉(zhuǎn)錄。本研究通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法研究轉(zhuǎn)錄因子GATA-1 與UL111A 基因5'上游DNA 序列的相互作用，探討二者在HCMV 潛伏及再激活感染中可能發(fā)揮的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料

HCMV AD169 株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，人白血病單核細(xì)胞(THP-1 細(xì)胞)購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，GATA -1 兔抗人抗體購(gòu)于Abcam，TaKa-Ra 公司合成PCR 引物，ChIP 試劑盒購(gòu)自Upstate，細(xì)胞核蛋白提取試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

2 HCMV 潛伏感染和激活感染細(xì)胞模型建立及分組

2.1 細(xì)胞感染模型建立 THP -1 細(xì)胞于Gibco 常規(guī)RPMI-1640 培養(yǎng)液，10%特級(jí)胎牛血清，1 ×105U/L 青霉素，100 mg/L 鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HCMV AD169 株以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=1 感染THP -1 細(xì)胞(1 ×109/L)。100 μg/L 12 -肉豆蒄酸-13 -乙酸佛波酯(phorbol 12 -myristate 13 -acetate，PMA)刺激HCMV 潛伏感染的THP -1 細(xì)胞，細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 后，分別提取細(xì)胞總RNA，RT -PCR 檢測(cè)HCMV UL123 基因和UL82 基因的表達(dá)。UL123 基因表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白IE，設(shè)計(jì)上游引物序列為5'-CAAGAG AAAGATGGACCCTG - 3'，下游引物序列為5' -CGAGTTCTGCCAGGACATC - 3'，目的擴(kuò)增片段為242 bp;UL82 基因表達(dá)被膜蛋白pp65，設(shè)計(jì)上游引物序列為5'-TGCCCTGGATGCGATACTG -3'，下游序列引物為5'-AGGACCTGACGATGACCCG -3'，目的擴(kuò)增片段為378 bp，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCMV DNA 載量，透射電鏡觀察THP-1 細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒。根據(jù)上述指標(biāo)，綜合判斷病毒感染狀態(tài)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 HCMV AD169 株以MOI =1 感染THP-1 細(xì)胞(1 ×109/L)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后作為潛伏感染組;100 μg/L PMA 刺激HCMV 潛伏感染的THP -1 細(xì)胞，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h 后作為激活感染組;對(duì)照組加入相同量的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。

3 RT－PCR 分析HCMV 潛伏及再激活感染時(shí)cmvIL－10 的表達(dá)

Trizol 法提取HCMV 潛伏及再激活感染96 h 后細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)cmvIL - 10 及內(nèi)參照GAPDH 的PCR 引物，cmvIL - 10 上游引物5' - GGGGAATTCATGCTGTCGGTGATGGTCT - 3'，下游引物5' -ACATTGCCGCATGTCTTTG-3'，目的擴(kuò)增片段為381 bp;GAPDH 上游引物5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT - 3'，下游引物5' - GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，目的擴(kuò)增片段為185 bp。PCR 擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

4 Western blotting 檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子GATA－1 的表達(dá)

利用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取對(duì)照組，HCMV潛伏感染組和激活感染組核蛋白，然后進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)，利用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值，目的條帶與內(nèi)參照條帶灰度值的比值表示GATA-1的相對(duì)表達(dá)量。

5 HCMV UL111A 5’上游序列GATA－1 結(jié)合部位的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析

應(yīng)用TRANSFAC 數(shù)據(jù)庫(kù)中的MATCH 工具對(duì)HCMV UL111A 5’上游序列轉(zhuǎn)錄因子GATA-1 結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，采用TRANSFAC Professional 9.4 庫(kù)中的單核苷酸加權(quán)模型集對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行打分，通過(guò)每個(gè)位點(diǎn)所得分?jǐn)?shù)(0 ～1)來(lái)確定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況，從中選出轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)表1，并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的ChIP-PCR 引物，見(jiàn)表2。GATA - 1 結(jié)合序列預(yù)測(cè)分析和引物設(shè)計(jì)時(shí)選用HCMV AD169 株全基因序列RefSeq FJ527563. 1，HCMV UL111A 5’上游序列堿基起止位為155 755 ～160 632。

6 ChIP－PCR 試驗(yàn)

采用Upstate 公司的ChIP 試劑盒處理HCMV 潛伏與激活感染組細(xì)胞，操作步驟如下:加入37%甲醛體外交聯(lián)和裂解細(xì)胞DNA，超聲處理(功率500W，超聲7s，停10s，重復(fù)3 次)DNA，使交聯(lián)的DNA/蛋白質(zhì)共沉淀，洗脫DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物，解交聯(lián)，純化DNA。在交聯(lián)的DNA/蛋白質(zhì)共沉淀過(guò)程中，分為input 和IP 組，input 組不加入GATA -1 抗體，IP 組加入GATA-1 抗體。嚴(yán)格按照ChIP 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

表1 轉(zhuǎn)錄因子GATA－1 結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 1. The predicted results of binding sites of transcription factor GATA-1

表2 GATA－1 的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物Table 2. The primers based on the predicted binding sites of transcription factor GATA-1

將各組得到的DNA 產(chǎn)物分別加入上述引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下:10 ×Ex Taq buffer 2.5 μL，2. 5 mmol/L dNTP 2. 5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL，20 μmol/L 上、下游引物各0.5 μL，DNA 2 μL，5 U/μL Taq 酶0.125 μL，加ddH2O 至25 μL。反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性5 min，繼而94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系如下:SYBR Premix Ex TaqTM(2 ×)10 μL，20 μmol/L 上、下游引物0. 4 μL，DNA 2 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，加ddH2O 至20 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min，繼而94 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)后72 ℃10 min，AB7500熒光定量PCR 儀檢測(cè)。以-ΔCt 值來(lái)表示HCMV 潛伏與激活感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1 與UL111A 5’上游各位點(diǎn)的結(jié)合率，ΔCt 為IP 組與input 組的Ct 差值(CtIP-Ctinput)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本t 檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)采用方差分析，以P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HCMV 潛伏及再激活感染細(xì)胞模型的建立

1.1 HCMV 潛伏感染細(xì)胞模型的建立 HCMV AD169 株感染THP -1 細(xì)胞96 h 后，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有病毒顆粒，見(jiàn)圖1。HCMV UL123 基因PCR 擴(kuò)增片段為242 bp，表達(dá)量隨著時(shí)間的增加逐漸減少;未檢測(cè)到HCMV UL82 基因的表達(dá)，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Electron micrographs of HCMV - infected THP - 1 cells (×50 000).The arrows indicate the viral particles.圖1 HCMV 感染THP－1 細(xì)胞電鏡圖

Figure 2. The expression of HCMV UL82 and UL123 genes in HCMV-infected THP-1 cells.M:DL2000 marker.圖2 HCMV 感染THP－1 細(xì)胞96、72、48、24 及12 h 后UL123 和UL82 基因的表達(dá)

1.2 HCMV 再激活感染細(xì)胞模型的建立 PMA 刺激HCMV 潛伏感染細(xì)胞96 h 后，懸浮生長(zhǎng)的THP -1 細(xì)胞轉(zhuǎn)為貼壁生長(zhǎng)，電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)較多病毒顆粒，見(jiàn)圖3。HCMV UL123 基因表達(dá)量先隨著時(shí)間的增加而增加，后逐漸減少，UL82 基因PCR 擴(kuò)增片段為378 bp，96 h 時(shí)檢測(cè)到表達(dá)，見(jiàn)圖4。

Figure 3. Electron micrograph of an HCMV -latently -infected cell stimulated by PMA(×30 000). The arrows indicate the viral particles.圖3 PMA 刺激HCMV 潛伏感染細(xì)胞電鏡圖

Figure 4. The expression of HCMV UL123 and UL82 genes in HCMV - reactivatedly - infected cells. M:100 bp DNA ladder marker.圖4 HCMV 再激活感染THP－1 細(xì)胞96、72、48、24 及12 h后UL123 和UL82 基因表達(dá)

2 HCMV 潛伏與再激活感染時(shí)UL111A 的表達(dá)

HCMV 潛伏感染時(shí)，RT-PCR 未擴(kuò)增出UL111A基因表達(dá)的cmvIL-10，再激活感染時(shí)表達(dá)cmvIL -10，擴(kuò)增片段為381 bp，見(jiàn)圖5。

Figure 5. RT - PCR amplification results of cmvIL -10. 1，3:HCMV reactivated and latent infection，respectively;2，4:GAPDH;M:100 bp DNA ladder marker圖5 cmvIL－10 mRNA RT－PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 Western blotting 分析HCMV 潛伏及再激活感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA－1 的表達(dá)

HCMV 潛伏及再激活感染后，分別提取感染的細(xì)胞核內(nèi)蛋白進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)，HCMV 潛伏與激活感染后均檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 表達(dá)，見(jiàn)圖6。同時(shí)，HCMV 潛伏感染組轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 的相對(duì)表達(dá)量(1. 13 ± 0. 08)高于激活感染組(0.51 ±0.11)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

4 HCMV 潛伏及再激活感染時(shí)ChIP 結(jié)果分析

以input 組和IP 組DNA 為模板，用預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的9 對(duì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示5對(duì)引物(GATA -12 引物、GATA -21 引物、GATA -22 引物、GATA-23 引物和GATA -26 引物)均擴(kuò)增出目的條帶，擴(kuò)增片段分別為202 bp、208 bp、250 bp、245 bp 和198 bp，見(jiàn)圖7、8，其對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子GATA-1 結(jié)合位點(diǎn)分別是1119(-3760)位點(diǎn)、107(-4772)位點(diǎn)、609(-4270)位點(diǎn)、849(-4030)位點(diǎn)和2047(-2832)位點(diǎn)，見(jiàn)圖9。前面位點(diǎn)為分析獲得，括號(hào)內(nèi)位點(diǎn)為根據(jù)規(guī)定算得。

Figure 6. The expression of transcription factor GATA-1 in HCMV latent and reactivated infection.1:control group;2:HCMV latent infection group;3:HCMV reactivated infection group. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs HCMV latent infection group.圖6 Western blotting 分析HCMV 潛伏及再激活感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA－1 表達(dá)

用上述5 對(duì)引物進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果顯示HCMV 再激活感染組轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 與UL111A基因5’端上游序列5 個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合率(-1.13 ±0.07、-0.63 ±0.05、-1.10 ±0.07、-0.24 ±0.03和-0. 14 ± 0. 01)均高于潛伏感染組(- 4. 00 ±0.26、-4.50 ±0.33、-4.41 ±0.21、-3.61 ±0.20和-3.47 ±0.11)。經(jīng)兩樣本t 檢驗(yàn)，5 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 的結(jié)合率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)圖10。

討 論

Figure 7. PCR product electrophoresis of HCMV latent infection after ChIP.A and B was input group and antibody treatment group，respectively.1:negative control group;2 ～6:amplified products of 1119(-3760)site，107(-4772)site，609(-4270)site，849(-4030)site and 2047(-2832)site，respectively;M:100 bp DNA ladder marker.圖7 HCMV 潛伏感染時(shí)ChIP 處理后PCR 產(chǎn)物電泳圖

Figure 8. PCR product electrophoresis of HCMV reactivated infection after ChIP. A and B was input group and antibody treatment group，respectively.1:negative control group;2 ～6:amplified products of 1119(-3760)site，107(-4772)site，609(-4270)site，849(-4030)site and 2047(-2832)site，respectively;M:100 bp DNA ladder marker.圖8 HCMV 激活感染時(shí)ChIP 處理后PCR 產(chǎn)物電泳圖

Figure 9. The binding sites of transcription factor GATA-1 on 5 'upstream DNA sequence of UL111A gene.圖9 HCMV UL111A 基因5’端上游核酸序列轉(zhuǎn)錄因子GATA－1 的結(jié)合位點(diǎn)

Figure 10. Comparison of transcription factor GATA -1 binding rates in latent and reactivated infection.1 ～5:1119(-3760)site，107(-4772)site，609(-4270)site，849(-4030)site and 2047(-2832)site，respectively. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs HCMV latent infection.圖10 HCMV 潛伏及再激活感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA－1 結(jié)合率的比較

目前認(rèn)為，單核細(xì)胞和髓系早期細(xì)胞是HCMV潛伏感染的主要細(xì)胞，一旦分化為巨噬細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞，病毒的早期基因表達(dá)就會(huì)被激活，HCMV 可由潛伏感染向再激活轉(zhuǎn)化［7-10］。然而，HCMV 病毒由潛伏狀態(tài)向再激活轉(zhuǎn)化的機(jī)制還缺乏更深入的研究。HCMV 具有高度種屬特異性，不能用動(dòng)物模型對(duì)其直接進(jìn)行研究;在健康攜帶者的外周血和骨髓細(xì)胞中，被潛伏感染的細(xì)胞所占的比例很少，僅為0.004% ～0.010%，且在每個(gè)被潛伏感染的細(xì)胞中約含有2 ～13 個(gè)病毒基因組DNA，難以滿(mǎn)足當(dāng)前研究的需求。雖然有很多針對(duì)CMV 的模型，由于HCMV具有高度的種屬特異性，針對(duì)CMV 的模型不能用于HCMV 的研究。因此，我們參考國(guó)內(nèi)外的研究建立了HCMV 潛伏及再激活感染的THP-1 細(xì)胞模型。

HCMV 潛伏感染時(shí)，UL111A 基因不表達(dá)cmvIL-10，激活感染時(shí)表達(dá)cmvIL -10。我們對(duì)UL111A 5’端上游約5.0 kb 的序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中交錯(cuò)分布著轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 的結(jié)合位點(diǎn)，由此推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 可能參與了HCMV潛伏及再激活感染過(guò)程。本研究中，我們證實(shí)了HCMV 潛伏感染時(shí)，UL111A 基因不表達(dá)cmvIL -10，激活感染時(shí)表達(dá)。同時(shí)，Western blotting 分析結(jié)果表明HCMV 潛伏感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA -1 的表達(dá)量高于再激活感染時(shí)，這可能與GATA -1 抑制單核細(xì)胞的分化有關(guān)。

染色質(zhì)免疫沉淀［11］是體內(nèi)研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用強(qiáng)有力的方法，此方法不需要分別提取核酸或蛋白，在天然的染色質(zhì)環(huán)境下進(jìn)行，基本保持了二者在細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)結(jié)合狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)GATA-1 抗體，特異性將超聲打斷的DNA -GATA-1 復(fù)合物小片段免疫沉淀，并純化解交聯(lián)，獲得GATA-1 結(jié)合的DNA 片段，對(duì)純化獲得的DNA 片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子GATA-1 可與UL111A 5’端上游序列107(-4772)位點(diǎn)、609 (- 4270)位點(diǎn)、849 (- 4030)位點(diǎn)、1119(-3760)位點(diǎn)和2047(-2832)位點(diǎn)共5 個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，且激活感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA-1 的結(jié)合率高于潛伏感染。我們推測(cè)HCMV 激活感染后轉(zhuǎn)錄因子GATA-1 可能通過(guò)與UL111A 基因5’上游序列結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，啟動(dòng)cmvIL-10 的轉(zhuǎn)錄，參與HCMV 再激活感染的過(guò)程。本文研究結(jié)果僅是初步的探索性結(jié)果，應(yīng)做進(jìn)一步的驗(yàn)證性研究，如用報(bào)告基因技術(shù)等。更深入地研究GATA -1 如何與UL111A 基因5’上游序列潛在結(jié)合位點(diǎn)作用，不同位點(diǎn)的缺失是否影響GATA-1 的調(diào)控功能，哪個(gè)位點(diǎn)是GATA-1的關(guān)鍵結(jié)合區(qū)域，是否存在其它的核轉(zhuǎn)錄因子或共調(diào)控蛋白作用這些區(qū)域?相信隨著這些問(wèn)題的逐步闡明，將有利于更全面地理解在轉(zhuǎn)錄水平HCMV 潛伏及再激活感染的調(diào)控機(jī)制。

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