HPLC-ESI-MS/MS 分析姜黃中姜黃素類化合物

蔣建蘭 ，靳曉麗，喬 斌，元英進(jìn)

系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室天津市生物與制藥工程重點實驗室天津大學(xué)化工學(xué)院制藥工程系，天津300072

姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖，被廣泛用于食品調(diào)料、著色劑以及中藥，藥理研究表明具有抗腫瘤、消炎、抗氧化、抗艾滋病、抗老年癡呆、降血脂等作用［1-3］。1985 年Kuttan 等［4］首次提出姜黃與姜黃素具有抗腫瘤活性。此后，有關(guān)這方面研究逐漸成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點。其中姜黃素已被美國國家癌癥研究所(NCI)列為第三代防癌藥物［5］。姜黃主要抗腫瘤活性成分為姜黃素類化合物［6-8］。其中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素是最常見的3 種化合物，此外，姜黃屬植物中還含有許多微量的姜黃素類化合物，許多研究表明這些微量成分與3 個常見成分有著相似甚至更好的藥理活性［9-13］?，F(xiàn)已從姜黃中發(fā)現(xiàn)了28種姜黃素類化合物，吳宏偉等［14］將這28 種化合物歸納為12 種母核和4 種取代基的組合。

目前，許多檢測方法都已用于姜黃素類化合物研究，主要有液質(zhì)聯(lián)用［15-21］、薄層色譜［22，23］、毛細(xì)管電泳［24］等，大多研究主要分析姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素3 種常見化合物，少有文獻(xiàn)報道分析其它微量姜黃素類化合物。李偉等［15］利用ESI 離子源，正離子模式掃描，在多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)下對目標(biāo)成分進(jìn)行定性分析，建立了HPLCESI-MS/MS 分析方法。利用質(zhì)譜碎裂規(guī)律，分別對每個目標(biāo)成分同時監(jiān)測8 個母離子/特征子離子對的反應(yīng)過程，從姜黃中檢測出6 種姜黃素類化合物。Hongliang Jiang 等［20］用ESI 離子源，正負(fù)兩種掃描模式，結(jié)合DAD 檢測模式，建立了姜黃LC-ESI-MS/MS 分析方法，共檢測出19 種姜黃素類化合物。

本文通過色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化，利用HPLCESI-MS-MS 方法從姜黃中同時檢出28 種姜黃素類化合物(見表1)，其中20 種化合物與文獻(xiàn)報道一致［9，10，15，20］，另外8 種化合物筆者尚未見從姜黃中報道，并解析了它們的二級質(zhì)譜斷裂規(guī)律。本文為更加全面研究姜黃中姜黃素類化合物提供參考。

表1 姜黃中鑒別出的姜黃素類化合物Table 1 Curcuminoids identified in Curcuma longa L.

母核和取代基Mother nuclears and substituents

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國熱電集團(tuán)Finnigan Surveyor 液相系統(tǒng);Finnigan 離子阱質(zhì)譜儀，型號為LCQ Deca XP MAX;

乙腈(色譜純，美國Merck 公司)，甲醇(色譜純，美國Merck 公司)，甲酸(美國fluka)，Millipore超純水。

姜黃素(20100318)、去甲氧基姜黃素(20100318)、雙去甲氧基姜黃素(20100318)對照品購于鼎瑞化工(上海)有限公司;

姜黃根莖(20100301)購于河北安國，由天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖。

1.2 對照品溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素對照品，用甲醇溶解并定容至10 mL 的容量瓶中，于4 ℃下保存待用。

1.3 色譜條件

色譜柱:Venusil XBP C18(2. 1 ×150mm，5μm，Agela Technologies)。流動相:A 相為水(0. 1% 甲酸)，B 相為乙腈(0.1%甲酸)。梯度洗脫條件:0～2 min，10%B-10%B;2～57 min，10%B-100%B;57～60 min，100%B-100%B。柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流速:0.2 mL/min。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI);正負(fù)離子同時掃描;Full Scan;噴霧電壓4.5 kV;毛細(xì)管溫度350 ℃;吹掃氣壓力10 arb;輔助氣流速40 arb;質(zhì)量掃描范圍:正離子為m/z 100～1000，負(fù)離子為m/z 150～1000;二級質(zhì)譜碰撞能量(CID):35 eV。

1.5 樣品前處理

首先將姜黃粉碎，過40 目篩，準(zhǔn)確稱量約50 mg 的姜黃粉末置于1000 mL 具塞錐形瓶中，加入500 mL 無水甲醇，混勻，超聲萃取45 min，過濾并收集濾液，50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無液體蒸出，將剩余的稠狀液體轉(zhuǎn)移至離心管，15000 rpm 離心10 min，吸取離心后的稠狀液體約1 mL 并用甲醇定容于10 mL 棕色容量瓶，以0.22 μm 微孔濾膜過濾，濾液供分析。

圖1 負(fù)離子模式(a)和正離子模式(b)下的總離子流圖Fig.1 Total ion current (TIC)chromatograms from negative ion mode(a)and positive ion mode(b)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜質(zhì)譜分離條件的優(yōu)化

HPLC-ESI-MS-MS 具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、樣品前處理簡單的特點，是分析中藥、鑒定中藥復(fù)雜體系的首選方法。本文通過對比其他類型的色譜柱，最終采用通用型、非極性且具有廣泛pH 適用范圍(1.5～10.0)的Venusil XBP C18型色譜柱，它適用于各類非極性、極性化合物，穩(wěn)定性好，酸或堿性流動相下都有較好的使用壽命;采用常用流動相體系乙腈-水，因姜黃素類化合物含有酚羥基，易出現(xiàn)色譜峰拖尾，為了改善峰形，經(jīng)對比試驗在流動相中添加0.1%甲酸效果最好。調(diào)節(jié)流動相洗脫程序確定了梯度條件，得到了優(yōu)化的色譜分離效果，正、負(fù)總離子流圖，見圖1。

圖2 姜黃素類化合物的正離子二級圖譜(左)和負(fù)離子二級圖譜(右)Fig.2 Positive ion (+)ESI/MS/MS (left)and negative ion (-)ESI/MS/MS (right)of curcuminoids

姜黃素類化合物大都含有酚羥基，在負(fù)離子模式下此類化合物比較容易電離，但對樣品中含量過低的化合物不夠敏感，而正離子模式對微量化合物靈敏度較高，特別是含有O 和N 原子的物質(zhì)更是易質(zhì)子化而被檢測出來［15］。本文以姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素作為目標(biāo)物質(zhì)，在正負(fù)離子兩種模式下進(jìn)行母離子全掃描，優(yōu)化毛細(xì)管溫度、噴霧電壓、吹掃氣壓力、鞘氣流速等參數(shù)，得到目標(biāo)物質(zhì)最強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰。然后對選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，在優(yōu)化的條件下得到目標(biāo)物質(zhì)的二級質(zhì)譜圖，其中筆者未見文獻(xiàn)報道的8 種化合物的二級質(zhì)譜圖見圖2。

2.2 姜黃素類化合物的質(zhì)譜解析

姜黃素類化合物在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為［M +H］+，負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰主要是［M–H］–，除此還有少量的［M–H+HCOOH］–。采用提取離子流(EIC)方式找到了28 個明顯特征峰，根據(jù)譜峰的保留時間和質(zhì)譜一、二級離子碎片信息，并結(jié)合對照品及參考文獻(xiàn)信息，進(jìn)行色譜峰的化合物歸屬分析。姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素3 種物質(zhì)通過與對照品的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比確定，其它25 種化合物通過與這3 種常見姜黃素類化合物的色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及二級斷裂方式的比較中推測鑒定。這28種化合物中有20 種與文獻(xiàn)報道一致［9，10，15，20］，包含雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素(化合物23、24 和25)。其它8 種物質(zhì)解析如下:

化合物2:3，5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羥基苯基)-庚烷。

(–)ESI-MS 檢測到準(zhǔn)分子離子［M – H］–為m/z 361，保留時間為17.23 min，觀察它的二級質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)碎片比較少，母離子很難被打碎，推測此種物質(zhì)缺少氧化性基團(tuán)而不易碎裂，從保留時間和二級質(zhì)譜碎片信息初步推斷與化合物1，7-bis(4-hydroxyphenyl)-3，5-heptanediol 為同一系列物質(zhì)(母核骨架為庚烷-3，5-二醇)［20］，分子量相差46，推測比文獻(xiàn)化合物多一個羥基和一個甲氧基，初步推斷為3，5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羥基苯基)-庚烷。分析二級質(zhì)譜圖，m/z 361 準(zhǔn)分子離子峰產(chǎn)生了m/z 179、165、223、209 共4 個主要二級碎片，在電噴霧電離過程中，羥基碳和臨碳之間容易斷裂，分別失去一個中性分子得到碎片m/z 179、165、223、209。根據(jù)裂解方式可以推測該化合物即為3，5-二羥基-1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(3，4-二羥基苯基)-庚烷。該化合物含有較多羥基，對負(fù)離子檢測模式比較敏感(見圖2 和圖3)。

圖3 化合物2 在負(fù)離子模式下的二級碎片F(xiàn)ig.3 (-)ESI-MS/MS fragmentation of curcuminoid 2

化合物10:1-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯-3-酮。

(+)ESI-MS 檢測到準(zhǔn)分子離子［M + H］+為m/z 383，保留時間為22.32 min，初步推斷與化合物8 和9 為同一系列化合物(母核骨架為1，4，6-庚三烯-3-酮)，分子量比9 多30，即多一個甲氧基，初步推斷為1-(4-羥基-3，5-二甲氧基苯基)-7-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1，4，6-庚三烯-3-酮。分析二級質(zhì)譜圖，m/z 383 準(zhǔn)分子離子峰沒有產(chǎn)生碎片，在電噴霧電離過程中，因為存在三個雙鍵的共軛結(jié)構(gòu)，母離子很難被打碎，推測確實是同一系列物質(zhì)。

化合物11 和12:環(huán)雙去甲氧基姜黃素、環(huán)去甲氧基姜黃素。

檢測到準(zhǔn)分子離子峰［M + H］+分別為m/z 309、339;［M–H］–分別為m/z 307、337，保留時間分別為22.95 min 和23.31 min，二級碎片和雙去甲氧基姜黃素(23)、去甲氧基姜黃素(24)的二級圖譜幾乎相同，雖然保留時間不同，但二級斷裂方式基本一致，推測它們?yōu)橥之悩?gòu)體，已有文獻(xiàn)報道姜黃中存在環(huán)姜黃素［10］，它是姜黃素的同分異構(gòu)體，推測化合物13 為環(huán)姜黃素，故化合物11 和12 分別推測為環(huán)雙去甲氧基姜黃素、環(huán)去甲氧基姜黃素。

化合物15、16 和17:結(jié)構(gòu)暫未推斷。

檢測到準(zhǔn)分子離子峰［M + H］+分別為m/z 293、323、353，保留時間分別為26. 91 min、27. 61 min、28.16 min，二級碎片分別為m/z 199、225;m/z 229、255;m/z 259、285。分子量和二級碎片均相差30(一個甲氧基)，說明它們具有相同的斷裂方式，推測為同一系列化合物，目前還沒有推測出它們的具體結(jié)構(gòu)。雖然文獻(xiàn)中已有分子量為292 的姜黃素類化合物報道［25］，但它的結(jié)構(gòu)和化合物8、9 是同一系列。

化合物19:1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基苯基)-庚烷-3，5-二酮。

(-)ESI-MS 檢測到準(zhǔn)分子離子［M-H］–為m/z 341，保留時間為30.74 min，推斷與化合物18 為同一系列物質(zhì)(母核骨架為庚烷-3，5-二酮)，分子量相差30，推測比化合物18 多一個甲氧基，初步推斷為1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基苯基)-庚烷-3，5-二酮。分析二級質(zhì)譜圖，m/z 341 準(zhǔn)分子離子峰產(chǎn)生了m/z 205、235、219 共3 個主要二級碎片，在電噴霧電離過程中:(1)發(fā)生重排反應(yīng)，并失去一個中性分子，得到碎片m/z 205。(2)發(fā)生重排反應(yīng)，并失去一個中性分子，得到碎片m/z 235。(3)通過氫轉(zhuǎn)移失去一個中性分子，得到碎片m/z 219。根據(jù)裂解方式可以推測該化合物即為1-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-7-(4-羥基苯基)-庚烷-3，5-二酮。因為含量低，(+)ESI-MS/MS 檢測沒有得到響應(yīng)(見圖2和4)。

圖4 化合物19 在負(fù)離子模式下的二級碎片F(xiàn)ig.4 (-)ESI-MS/MS fragmentation of curcuminoid 19

3 結(jié)論

本文應(yīng)用HPLC-ESI-MS-MS 的方法，根據(jù)譜峰信息，并結(jié)合對照品和參考文獻(xiàn)信息，同時檢測出28 種姜黃素類化合物，根據(jù)母核骨架結(jié)構(gòu)可以劃分為幾個系列，同一系列的化合物具有相同的斷裂方式。姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素這3 種物質(zhì)是通過與對照品對比鑒定的，以此為基礎(chǔ)推測出其它25 種化合物，并細(xì)致分析了未見從姜黃中報道的8 種化合物的二級質(zhì)譜碎裂規(guī)律。

由于姜黃中微量姜黃素類化合物的含量低，難以鑒別，而該方法比較明確的同時檢測出28 種化合物，且靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性良好，說明該方法可用于姜黃中姜黃素類化合物的檢測，本文為姜黃中姜黃素類化合物的更加全面研究提供了參考。

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