雙水相體系萃取人參根中人參皂苷的研究

張 儒，張變玲，謝 濤，李谷才，田 竟，羅志勇

1湖南工程學院化學化工學院，湘潭411104;2中南大學生物科學與技術學院 分子生物學研究中心，長沙410078

人參(Panax ginseng C. A. Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物，自古以來擁有“百草之王”的美譽，更被東方醫學界譽為“滋陰補生，扶正固本”之極品。人參中含有皂苷、多糖和氨基酸等多種化學成分，其中主要藥用成分為人參皂苷。目前已從人參根中分離出如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Re、Rh 和Rf等50 余種人參皂苷，研究證明大多數人參皂苷單體具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細胞凋亡和增強免疫力等活性，已廣泛應用于臨床［1-5］。目前提取人參皂苷的方法有多種，如超聲波提取法、回流提取法、浸漬法和微波法等［5］。提取的溶劑主要為甲醇、乙醇和正丁醇等，但是這些有機溶劑對非皂苷類物質也具有較高的溶解性，使得提取純度和效率較低。雙水相萃取 (aqueous two-phase extraction，ATPE)是利用物質在兩相的分配差異進行提取的新型分離技術。不僅具有分離過程條件溫和、不存在有機溶劑殘留、處理容量大和易連續化操作等特點，還具有分相時間短、目標產物分配系數大、投資費用少、安全環保等優點［6，7］，在天然藥物活性成分的規模化生產方面具有很大的潛力。國內外有將雙水相體系用于天然活性成分提取分離的研究，但是利用其從人參中萃取人參皂苷的研究未見報道。本文研究人參粗提液在PEG/(NH4)2SO4雙水相體系中的分配行為，以探索提取人參皂苷的最佳條件，為人參皂苷的工業化生產提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料及主要試劑

人參根采集自吉林撫松，經湖南省藥品檢驗所趙勇鑒定為人參(P. ginseng C. A. Meyer);人參皂苷Re 標準品購自中國藥品生物制品檢定所;PEG、硫酸銨和香草醛等試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器

WND-200 型高速中藥粉粹機(浙江蘭溪市偉能達電器有限公司);BS323S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);KQ-100B 超聲波清洗器(昆山超聲波儀器有限公司);RE-52A 旋轉蒸發器(鞏義市英峪予華儀器廠);UV-2102PCS 型紫外-可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司);5418 型高速離心機(德國Eppendorf 公司)。

2 方法

2.1 人參粗提液的制備

［5］方法，取新鮮人參根自然風干至水分含量為0.5%，粉碎后用20 目篩過篩。稱取200.0 g，加入2 L 雙蒸水，室溫浸泡過夜，60 ℃超聲提取3 次，每次30 min，抽濾，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至20 mL，濃縮液即為人參粗提液。

2.2 人參皂苷含量測定

以人參皂苷Re 標準品為對照，采用香草醛-高氯酸顯色法檢測人參粗提液中總皂苷含量。精密稱取人參皂苷Re 標準品10.0 mg，加甲醇溶解定容至10 mL。分別移取上述溶液0.0、10、20、30、40、50、60、70 和80 μL 至具塞試管，60 ℃水浴中蒸干甲醇，精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，混勻。60 ℃水浴中加熱15 min，立即用自來水冷卻。最后加入5 mL 的冰醋酸搖勻，于全波段掃描，確定最大吸收波長為552 nm。552 nm測定各樣品吸光度值，以人參皂苷Re 濃度為橫坐標，吸光度A 為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為y=1.589x +0.0112 (r =0.9991)，結果表明:人參皂苷Re 在10.0～80.0 μg 范圍內線性關系良好。人參皂苷樣品均以制備標準曲線的方法測定。

2.3 雙水相體系建立

參考文獻［8］方法，將不同分子量的PEG 和(NH4)2SO4制成一定質量分數的原液，準確量取一定量的PEG 原液，加入50 mL 離心管中，然后加入(NH4)2SO4原液，混合，直至溶液開始出現混濁為止，記錄加入(NH4)2SO4的 量，算 出 PEG 和(NH4)2SO4在系統中的質量分數，再加入適量蒸餾水，使體系變澄清，計量加入蒸餾水的量，并繼續加入(NH4)2SO4原液，使系統再次變混濁，如此反復操作，計算混濁時PEG 和(NH4)2SO4在系統中的質量百分含量，從而繪制相圖。根據相圖規律確定穩定成相體系，進一步確定PEG/(NH4)2SO4雙水相體系的最佳萃取配比。

2.4 雙水相體系萃取人參皂苷

根據上述雙水相相圖，計算雙水相體系所需各成相物質的質量。分別稱取一定量的PEG、(NH4)2SO4加蒸餾水配成雙水相體系，然后加入1 mL 人參粗提液，再用蒸餾水定容，振蕩，充分混合均勻，靜置1 h，待萃取充分后，分別移出上相和下相，測定人參皂苷濃度，并計算體積比(R)、分配系數(K)和回收率(Y)。相關參數定義如下:R = Vt/Vb;K=Ct/Cb;Y=RK/(1 +RK)。其中Vt、Vb 分別為上、下相體積(mL)，Ct、Cb 分別為上、下相人參皂苷濃度。影響雙水相體系萃取的因素較多，實驗發現PEG 和(NH4)2SO4組成的雙水相體系中，靜置1 h 使人參皂苷萃取完全，萃取時間變化對人參皂苷的回收率影響較小。因而重點考察PEG 分子量、PEG/(NH4)2SO4質量分數、pH 和溫度對人參皂苷萃取的影響。

3 結果與討論

3.1 PEG/(NH4)2SO4 雙水相體系相圖

圖1 為采用濁點法以不同(NH4)2SO4質量分數為橫坐標，PEG 的質量分數為縱坐標，得到的雙水相體系相圖。圖1 顯示隨著PEG 質量分數下降，對應(NH4)2SO4質量分數逐漸上升，在(NH4)2SO4質量分數相同情況下，隨著PEG 分子量增加，形成雙水相體系所需的PEG 的質量分數相對較低;相反，PEG 質量分數相同時，形成雙水相體系所需的(NH4)2SO4質量分數較高，從圖中發現，雙水相體系的成相范圍為:(NH4)2SO4質量分數5. 1%～24.8%，PEG 質量分數3.7%～58.3%，在雙結線的上方才能形成雙水相，靠近臨界點的體系對PEG 的消耗量少，形成兩相較難;遠離臨界點則比較容易，體系對PEG 的消耗量多，過多PEG 使體系的粘度增加，兩相分離的時間延長。制備相圖時亦發現在PEG/(NH4)2SO4體系中，盡管在雙節點線上方成相范圍內，但是(NH4)2SO4質量分數為13%～22%，PEG 質量分數為12%～30%的雙水相體系兩相間有穩定的電位差，適合建立萃取人參皂苷的雙水相體系。故選擇14%(NH4)2SO4和30%不同分子量PEG 組合萃取人參皂苷，進而篩選出合適分子量的PEG。

圖1 PEG/(NH4)2SO4 雙水相體系相圖Fig.1 The phase diagram of PEG/(NH4)2SO4 ATPS

3.2 不同分子量PEG 對人參皂苷萃取的影響

根據相圖，選擇質量分數為30%的不同分子量(400、1000、3350 和6000)PEG 和14% (NH4)2SO4分別組成雙水相體系在pH 7、室溫條件下萃取人參皂苷，并分別測定R、K 和Y，結果見表1。在雙水相體系中，由于聚合物分子量的增加，分子內極性基團的比例相對降低，從而導致極性和親水性減小;PEG相和(NH4)2SO4相間的疏水性程度差距拉大，增加了相界面張力。并且PEG 分子量越大，體系的粘度越大，分相時間延長，分相困難。因此，合適的PEG分子量可能使PEG 相的極性和親水性與人參皂苷較為接近，有利于其對人參皂苷的萃取。但是當PEG 分子量過大時，溶液中的PEG 分子間的作用力增大，相粘度增大，使皂苷分子不易進入PEG 相。從表1 結果看出人參皂苷在PEG3350 雙水相體系中的分配系數最大，人參皂苷回收率最高。因此，PEG3350 比較適合人參皂苷萃取。

表1 不同分子量PEG 對人參皂苷萃取的影響Table 1 Effect of the molecular weight of PEG on the extraction of ginsenosides

3.3 不同質量分數PEG3350 與(NH4)2SO4 對人參皂苷萃取的影響

以不同質量分數的 PEG3350 和 14%(NH4)2SO4分別組成雙水相體系，在pH 7、室溫條件下萃取人參皂苷，分別測定R 和K，計算回收率Y，結果見圖2，由圖中可知，隨著PEG3350 質量分數的增加，Y 先增加后逐漸減小，在PEG3350 質量分數為12% 時達到最高。本實驗選擇12%PEG3350 與不同質量分數的(NH4)2SO4分別組成雙水相體系萃取人參皂苷，結果見圖3，(NH4)2SO4質量分數為16%時人參皂苷回收率最高。

3.4 pH 對人參皂苷萃取的影響

人參皂苷分子中含有羥基和甲基，pH 值影響人參皂苷的電性和極性，同時也影響PEG/(NH4)2SO4體系的相間電位，從而影響人參皂苷在雙水相體系中的分配。本實驗以12% PEG3350 與16%(NH4)2SO4組成的雙水相體系，室溫萃取條件下考察其在不同pH 值對人參皂苷萃取的影響，結果見圖4。從圖4 可以看出，pH 值越大，回收率Y 隨著pH 值的增大而減小。當pH 值為7.0 時，回收率最高，故選取pH 值為7.0。

圖4 不同pH 值對人參皂苷萃取的影響Fig.4 The effect of pH value on the extraction of ginsenosides

3.5 溫度對人參皂苷萃取的影響

溫度影響溶劑的活度和相的聚合物組成，溫度高有利于傳質，但是過高可能會導致人參皂苷分解。在12% PEG3350 與16% (NH4)2SO4組成的雙水相體系中，pH 值為7.0 的條件下，考察不同溫度對人參皂苷萃取的影響，結果見圖5，圖中表明，隨著溫度的升高，萃取回收率逐漸上升，最高可達到88.94%，溫度超過60 ℃后，回收率迅速下降。其原因可能是溫度過高導致人參皂苷部分分解，故選定最適溫度為60 ℃。

圖5 不同溫度對人參皂苷萃取的影響Fig.5 The effect of temperature on the extraction of ginsenosides

4 結論

綜上所述，利用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系萃取人參皂苷的方法可行。萃取人參皂苷的最佳雙水相體系組合為PEG3350/(NH4)2SO4，其最佳體系為12% PEG3350，16% (NH4)2SO4，pH 7. 0，溫度60 ℃。該體系對人參根提取物中人參皂苷有著較好的萃取效果。利用該體系萃取人參皂苷，回收率可達88.94%。該體系具有溶劑殘留少、萃取高效安全和操作簡便等優點，為人參皂苷萃取分離提供了一種新的有效方法。

參考文獻

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