次氯酸鈉對葡萄葉片組培褐變率的影響

溫鵬飛，王 蓓，張建成，牛鐵泉，倉國營，邢延富

（山西農業大學園藝學院，山西太谷030801）

組織培養又稱離體培養，狹義地講，是指用植物各部分組織（如形成層、薄壁組織、葉肉組織、胚乳等）進行培養獲得再生植株[1]。組織培養不僅可以快速繁殖優良種苗，而且還可以培育脫毒苗木，保持其優良性狀[2-3]。此外，組織培養也為育種提供了許多手段和方法，使育種工作能更有效地進行[4-6]。在組織培養中，外植體滅菌是最關鍵的一步。大田的園藝作物常常帶有各種各樣的病菌，因而，在接種前一定要對其進行徹底滅菌才可以保證后續試驗的成功。一般生產實踐上，多用自來水反復沖洗，之后用不同的滅菌劑進行殺菌，如酒精、次氯酸鈉和升汞等[7-9]。藥劑的濃度和滅菌時間決定了外植體的感染、褐化和愈傷組織的分化。藥劑濃度過大，滅菌時間過長，超過了細胞的忍耐力，細胞就會褐變死亡；但時間和濃度如果過短過輕，則可能無法殺死外植體表面的細菌[10-11]。因而，尋求最佳的藥劑及其濃度和時間組合，控制外植體褐變率，是組培成功的關鍵。

葡萄葉片富含多酚類物質，為避免其褐變率過高，往往需要進行一些藥劑處理，如抗壞血酸和PVP 等[12]。在完整植物體的細胞中，酚類化合物和多酚氧化酶分隔存在，因而比較穩定。當外植體切割后，切口附近細胞的分隔效應被打破，酚類化合物被多酚氧化酶氧化形成褐色的醌類化合物，醌類化合物又會在酪氨酸酶的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶系統失活，導致組織代謝紊亂，生長受阻，最終逐漸死亡[13-14]。研究表明，酶促褐變是由多酚氧化酶引起的。次氯酸鈉（sodium hypochlorite）是一種強氧化劑和消毒劑，能夠使多酚氧化酶在一定程度上失活，且具有較強的消毒能力，因而，常被作為易氧化褐變的外植體的滅菌劑[15-16]。

本研究以美樂葡萄的葉片為外植體，對次氯酸鈉濃度和滅菌時間進行梯度設置，在MS 培養基上接種且觀察，尋找褐變率最低的組合，以期為葡萄組織培養提供技術支持，并為后續的試驗奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

美樂葡萄（Vitis vinifera L. Merlot）葉片采自山西農業大學園藝站。選取面積為5 cm2左右幼嫩葉片[14]進行處理。

1.2 試驗方法

全部采用MS 培養基[17]，并添加激素4 mol/L 2，4-D 和2 mol/L 6-BA 以及3%蔗糖和7.5 g/L瓊脂，pH 值為5.8。

把采好的樣品進行預處理，即先用自來水反復沖洗約5 min，洗干凈表面的泥土污漬后，再用75%酒精浸泡30 s，之后用滅菌后的蒸餾水沖洗葉片上的酒精，最后用次氯酸鈉進行滅菌。次氯酸鈉滅菌時間分別為30（A1），60（A2），90（A3）s，濃度（w/V）分別為1%（B1），2%（B2）和3%（B3）。

把處理好的葉片接種在培養基上，貼好標簽，放入培養室進行培養（光培養16 h，暗培養8 h），5 d 后觀察感染褐變和愈傷情況。

2 結果與分析

2.1 接種后感染及愈傷組織發生情況

從圖1 和表1 可以看出，通過自來水沖洗后用酒精進行浸泡，不同濃度次氯酸鈉滅菌均能達到滿意的效果，各處理接種后均無污染現象發生。此外，次氯酸鈉各處理組中均有愈傷組織產生。這表明，次氯酸鈉滅菌效果能夠滿足后續試驗要求。

表1 葉片接種后污染及愈傷情況

2.2 次氯酸鈉濃度對褐變率的影響

不同濃度次氯酸鈉對葡萄葉片組培褐變率的影響如圖2 所示。由圖2 可知，不同濃度次氯酸鈉滅菌后褐變率因滅菌時間不同而存在明顯差異，且當滅菌時間不同時，不同濃度次氯酸鈉表現出不同的褐變率。當處理時間較短（30 s）時，高濃度次氯酸鈉褐變率較低；而當處理時間延長后，較高濃度（2%）則表現較好。這表明，次氯酸鈉的滅菌效果與滅菌時間關系密切。方差分析結果表明，1%，3%，2%處理兩兩之間差異達顯著水平。

2.3 次氯酸鈉滅菌時間對褐變率的影響

次氯酸鈉滅菌時間對褐變率的影響如圖3所示。

由圖3 可知，當次氯酸鈉濃度較低（1%）時，其褐變率隨處理時間延長而降低。這表明，低濃度次氯酸鈉處理在短時間（30 s）內難以達到最佳的滅菌效果。而當處理時間延長（60 s）后，褐變率因濃度不同而表現不同。當處理時間為60 s 時，2%次氯酸鈉處理褐變率最低；而當處理時間為90 s 時，3%濃度的褐變率最低。這表明，次氯酸鈉處理時間的延長和使用濃度具有互補性，也就是說，短時間處理應采用高濃度，而長時間處理則應使用低濃度。方差分析結果表明，90，60 s 處理與30 s 處理之間差異達顯著水平，90 s 處理與30 s 處理之間差異達極顯著水平。

2.4 次氯酸鈉濃度和處理時間互作對褐變率的影響

當同時考慮次氯酸鈉濃度和處理時間時，二者表現出明顯的互作效應（表2）。二因素互作的情況下，褐變率較小的組合為A1B2 和A2B2，且均在0.01 水平上與其他組合差異顯著，但二者之間差異不顯著。因此，這2 個組合為次氯酸鈉對美樂葡萄葉片組培的最優滅菌方案，即用2%的次氯酸鈉滅菌外植體葉片30～60 s。

表2 滅菌時間和藥劑濃度互作對褐變率影響的多重比較

3 討論

次氯酸鈉（sodium hypochlorite）是一種強氧化劑、漂白劑和消毒劑，其強氧化性可以使多酚氧化酶在一定程度上失活，且具有較強的消毒能力[15-16]。本試驗結果表明，次氯酸鈉對葡萄葉片組培中褐變率存在明顯的抑制作用，且其最佳處理方法為用2%的次氯酸鈉處理30～60 s。

前人研究結果表明，褐變的主要原因是由于多酚氧化酶的存在，且多酚氧化酶的活性與多酚濃度有關[18-24]。多酚濃度較低時，隨濃度的增加多酚氧化酶活力也增強；而當濃度繼續增加時，氧化反應速度上升緩慢，且后期有下降趨勢[25]。Yu等[18]對葡萄進行研究發現，從側生枝切取的莖尖比延長蔓更容易成活，進一步研究還發現，蔓的酚類物質比莖尖高。有研究表明，卡特蘭在新莖旺盛生長季節（6—9 月）的褐變率顯著增加，在生長較弱的冬春季則顯著減少，相反，紅豆杉在旺盛的生長季節的幼嫩莖段褐變少，愈傷組織的發生率高，這種季節性差異的主要因素也是由于植物體內酚類物質含量多少造成的[19-20]。

此外，正常組織（如葡萄葉片）雖然含有豐富的多酚類物質但并不發生褐變，則是由于細胞內酚類物質和PPO 的區域性所致[21]，細胞室結構的破壞，使底物和酶結合，這是褐變不可或缺的因素[22]。鞠志國等[23]研究發現，液泡是貯存酚類物質的場所且不含PPO，PPO 則主要分布在細胞質中。謝春艷等[26]研究也發現，有活性的PPO 定位于正常細胞的質體中，其他類型的PPO 則存在于各種囊泡中。這表明，正常情況下，細胞內PPO和多酚類物質的分布存在嚴格的細胞區隔。劉曼西[27]的研究同樣也證實，截斷酚類物質與多酚氧化酶的接觸可以有效地防止褐變。

本試驗結果表明，次氯酸鈉低濃度（1%）時，其褐變率均較高，這可能是由于濃度較低，難以抑制多酚氧化酶活性而導致褐變發生嚴重。當濃度為2%時，次氯酸鈉的濃度可以與多酚氧化酶發生反應，阻擋了多酚氧化酶與酚類物質的反應，因而，其褐變率下降；當次氯酸鈉的濃度繼續升高到3%時，不但阻擋了多酚氧化酶與酚類物質的反應，同時由于濃度較高，對植物細胞也造成了嚴重的影響，導致細胞死亡，因而，其褐變率再次升高。

此外，本試驗結果表明，當滅菌時間為30 s時，1%，2%和3%的褐變率依次為84%，52%和62%；當滅菌時間為60 s 時，其褐變率依次為73%，51%和82%，均表現為褐變率隨處理時間延長而有所降低。這可能是由于處理時間較短時，次氯酸鈉與葡萄葉片里的多酚氧化酶產生反應，低濃度的次氯酸鈉（1%）由于沒有足夠的底物濃度，而無法中和掉葉片中使酚類反應褐變的多酚氧化酶，所以，酚類物質會在和多酚氧化酶的接觸中褐化，因而，褐化率較高；當滅菌時間達到90 s 時，3 種濃度的次氯酸鈉幾乎對褐變率影響不大，均在70%左右。這可能是由于處理時間較長（90 s），次氯酸鈉與植物細胞接觸時間過長，其含量已不是褐變的決定因素，因此，無論次氯酸鈉濃度為多少，其褐變率均變化不大。

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