白羊草莖段愈傷組織誘導和植株再生

于 娜，董寬虎

（1.山西省林業職業技術學院園林系，山西太原030009；2.山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

白羊草（Bothriochloa ischaemum）是禾本科孔穎草屬多年生草本植物，是優良的牧草和水土保持植物，具有固土保水，生活力強，高產耐牧、耐踐踏，適口性強等優點，是飼用價值較高的放牧型禾草之一，廣泛分布于我國暖溫帶落葉闊葉林地帶，是控制水土流失和維持丘陵山地的原生態平衡的重要草種[1-2]。目前，關于白羊草組培再生體系的研究較少，僅20 世紀90 年代永杰等[3-4]進行過探討。

筆者在連續以白羊草成熟胚、真葉為外植體材料，成功建立了植株再生體系的基礎上[5-6]，以拔節期莖切段作為外植體，通過對其組織培養中愈傷誘導和植株再生情況進行研究，以期篩選出其在組織培養過程中較為合適的激素組合，為進一步開展白羊草的組織培養及分子生物學研究提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料來源

供試白羊草種子于2006 年10 月采自山西省太谷縣鳳山。該區海拔1 100 m，植被為喜暖灌草叢類草地，建群種為白羊草（Bothriochloa ischaemum），其千粒質量為0.697 5 g[7]。

待白羊草成熟胚培養出的1 月齡無菌幼苗長至拔節期時，截取0.5～1.0 cm 的帶節小段接種于供試的不同培養基上。

1.2 培養基配制、滅菌及培養室條件

以MSB（MS 無機鹽＋B5 有機成分）培養基加3%蔗糖、5%瓊脂粉制備基礎培養基，pH 值調至5.8；在121 ℃條件下滅菌20 min。誘導愈傷培養條件：黑暗培養，室溫為（25±2）℃。分化培養條件：光照16 h/d，室溫為（25±2）℃，光照強度為2 000～3 000 lx。

1.3 誘導培養基

1.3.1 誘導愈傷組織 共設5 個誘導培養基，在基礎培養基上分別附加2，4-D 2.0 mg/L 和不同質量濃度的6-BA（0（G1），0.2（G2），0.5（G3），1.0（G4），1.5（G5）mg/L）。每個處理接種莖段30 個，重復3 次。將誘導出的愈傷組織再接種至繼代培養基MSB＋2，4-D 1.0 mg/L 上進行培養。

1.3.2 誘導愈傷組織分化 將繼代培養后的愈傷組織轉移到附加有不同質量濃度6-BA 和NAA 的分化培養基中進行培養。共設7 個分化培養基，即J1.6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.03 mg/L；J2. 6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J3. 6-BA 0.1 mg/L＋NAA 0.07 mg/L；J4. 6-BA 0.03 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J5. 6-BA 0.04 mg/L ＋NAA 0.05 mg/L；J6.6-BA 0.06 mg/L＋NAA 0.05 mg/L；J7.6-BA 0.07 mg/L＋NAA 0.05 mg/L。每個處理接種愈傷20 個，重復3 次。

1.4 數據處理

1.4.1 定性指標 為衡量愈傷組織質量，根據其形態特征，把愈傷組織分為5 個等級[8]。1 級：愈傷組織呈乳白色、淡黃色，新鮮，質地中等，易碎，生長旺盛；2 級：愈傷組織呈乳白色，質地較松散，生長較快；3 級：愈傷組織呈青白色，透明水浸狀，生長緩慢；4 級：愈傷組織呈白色，頂部生有氣生根，生長遲緩；5 級：愈傷組織呈青白色，結構致密，質地堅硬，生長緩慢。

1.4.2 定量指標 對出芽率、愈傷組織誘導率、分化率進行了統計，每處理重復3 次。出芽率＝出芽數/接種外植體數×100%；出愈率＝產生愈傷組織塊數/接種種子數×100%；分化率＝產生綠色原基的愈傷組織數/接種愈傷數×100%。

2 結果與分析

2.1 不同誘導培養基對愈傷組織誘導的影響

試驗觀察表明，將莖段接種在誘導愈傷培養基（圖1-A）7 d 左右，莖節處開始膨大，15 d 左右開始產生愈傷組織（圖1-B），接種在不同誘導培養基上的莖段開始出愈時間差異不大，G1 處理出愈最早，而且量也多，出愈率達到35.83%（圖1-C，表1），G5 處理的出愈率也達到35.29%（表1），G2～G5 處理上的愈傷量隨著6-BA 質量濃度的提高而增加，但質量較差，30 d 后呈現褐色，顆粒致密，生活力較小。而G1 處理愈傷大多呈白色，愈傷團粒狀，致密，有生活力。因此，G1 處理對愈傷組織誘導最好。

表1 不同處理對白羊草莖段誘導愈傷的影響

2.2 白羊草愈傷組織的繼代

誘導出來的愈傷組織在誘導培養基上培養30 d 后，愈傷已明顯增長變大。但是由于出愈傷的部位一般在莖節處，且連接較緊密（圖1-C），所以，需要先在超凈工作臺上，無菌條件下用消毒過的刀鑷剝離愈傷組織，然后再繼代到2，4-D質量濃度為1.0 mg/L 的繼代培養基上，實現非胚性愈傷向胚性愈傷轉化，使致密或疏松的顆粒中胚性愈傷組織發生率提高。

本試驗中，白羊草成熟胚的胚性愈傷組織只能在形成松軟的非胚性愈傷之后，通過降低培養基中2，4-D 的質量濃度，使致密或疏松的顆粒中胚性愈傷組織發生率提高（圖1-D）。

2.3 白羊草愈傷組織的分化

無菌苗莖段誘導出的愈傷繼代7 d 后接種到分化培養基上。每5 d 觀察1 次，第8 天可以觀察到愈傷組織有綠色芽點出現，芽點雖多，但20 d 后才可以觀察到有少量叢生芽產生，隨著分化愈傷增長至2～3 cm，多數芽點變褐，一般最后1 個愈傷只分化1 個不定芽。1 個月后可長至20 cm 左右，同時根系發達（圖1-E），此時即可煉苗后移栽，植株生長良好（圖1-F）。只有少數分化植株未長出根，將未分化出根的小苗轉入無任何激素的培養基中即可生根。

由表2 可知，J1～J3 分化培養基中6-BA 保持在0.1 mg/L 時，NAA 在0.03，0.05，0.07 mg/L變化時愈傷分化率不顯著（P＜0.05），以J2 分化率為最高。當降低6-BA 質量濃度，保持NAA 質量濃度為0.05 mg/L 時，J3～J7 處理的分化率差異顯著，尤以6-BA 在0.07 mg/L 時分化率為最高，達到82.62%；其次為6-BA 0.06 mg/L，分化率為79.37%；但當6-BA 質量濃度降低至0.03，0.04 mg/L 時，分化率急劇下降，說明6-BA 對分化率有顯著影響（P＜0.05）。

表2 不同分化培養基對莖段愈傷分化的影響

3 討論

愈傷在1 個月后增大至1.5～2.0 cm，此時不定芽陸續出現，1 個愈傷塊上通常有10～20 個綠色芽點，少部分愈傷分化前先出現紫色的小點，后逐漸才轉為綠色。產生部位一般在莖節處，愈傷組織包裹著莖節，一般為結構松軟、白色的非胚性愈傷組織，少數愈傷組織在莖段切口處產生。

Griffin 等[9-11]對早熟禾、大麥、狗牙根、高羊茅的研究結果表明，在誘導培養基中添加較低質量濃度的6-BA，可促進胚性愈傷組織的形成，提高愈傷質量，增加其再生能力。在培養基中加入細胞分裂素的目的，主要是為促進細胞分裂和不定芽的形成，打破頂端優勢，有利于形成叢生芽并增殖[12]。長期以來，人們廣泛地把生長素/細胞分裂素的值運用于組培中，二者的比例決定著芽和根的分化。一般來說，當生長素/細胞分裂素的值高時，有利于長根，低時有利于長芽，中間值有利于愈傷組織的誘導和分化[13]。本試驗中，誘導培養基上的莖段不僅有愈傷誘導，還有側芽產生，隨著6-BA 質量濃度的提高，出芽率增加，但增長幅度不大。本試驗沒有篩選出側芽的增殖和生根誘導的培養基組合。

植物體內同時存在數種植物激素，它們之間可相互促進增效，也可相互拮抗抵消[14]。在植物生長發育過程中，任何一種生理過程往往不是培養基中某一激素的單獨作用，而是培養基中多種激素相互作用的結果[15]。

大量研究表明，誘導植株再生能否成功，受內因和外因的共同影響，內因是指植物組織的來源、年齡、生理狀態和發育時期等，而外因則是指培養條件和預處理等。同一材料的不同外植體在相同的培養條件下培養時，其再生能力也存在差異。通過試驗發現，白羊草成熟種子與真葉、莖段在愈傷組織及不定芽的誘導上差異顯著，成熟種子更利于白羊草高效植株再生體系的建立。同時還發現，外植體的接種方法，如接種密度、分割大小等均會影響白羊草植株再生，如用無菌苗莖節片斷為外植體的愈傷誘導率不高，一個原因有可能是這部分組織本身的分生能力較差；另一個原因可能是試驗過程中沒有準確地切取所需部位，造成出愈率低。

前人研究表明，在相同的分化培養基上，成熟種子分化率很高，說明相同種類的激素配比對同一植物的不同器官組織培養有不同的效果，也就是同一材料的不同外植體在相同的培養條件下，其再生能力也存在差異。

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