液相色譜梯度洗脫法檢測石蒜組織中4種內源激素的方法

付曉陸，汪少敏，徐 敏

(1.浙江省余姚市農技總站 農產品質量檢測站，浙江 余姚 315400;2.杭州植物園，浙江 杭州 310000)

石蒜屬 (Lycoris Herb)植物是著名球根花卉，被譽為中國郁金香。近年來，在城市道路綠化改造以及花園景點綠化改造提升中對石蒜的需求越來越多，但石蒜自然繁殖率低滿足不了市場需求，需通過組培快繁才能在短期內達到規模化的種苗，而這需要測定石蒜組織中各激素的動態變化為前提［1］。

植物的內源激素與植物生長發育的基本規律和代謝過程的調節控制都密切相關，因此植物內源激素的準確測定，對植物生命活動和作物遺傳育種栽培領域的研究具有重要的意義。植物內源激素的檢測主要有氣相色譜法［2］、酶聯免疫法［3］、放射免疫法［4］和高效液相色譜法 (HPLC)［5-6］等。相對而言，HPLC法具有靈敏度高、專一性強和重復性好等特點，但HPLC定量分析要求上機檢測的樣品有相當高的純度，要求必須有適當的前處理方法，否則會直接影響HPLC法的測定結果。不同植物材料的組分差異甚大，因而尚無一種通用的植物材料前處理方法。石蒜球莖中富含多酚類和赤霉素類似物等雜質，如果前處理方法不當，上機檢測的樣品雜質含量過高，難以對目標組分進行有效的分離，造成定量困難，達不到檢測的目的。本方法是在總結前人研究的基礎上，結合石蒜組織組成的基本特點，經過實驗不斷改進總結，能滿足石蒜中IAA、ABA、ZT和GA3等4種植物內源激素的分析的要求，方法具有定量準確、能適應復雜基質干擾等特點。

1 材料和方法

1.1 材料試劑

用于本方法研究的石蒜由杭州植物園提供;內源激素標準品均購自SIGMA公司;聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)(國藥集團試劑公司);二乙基二硫代氨基甲酸 (國藥集團試劑公司)。

1.2 儀器和設備

本實驗采用的儀器為Waters2695/2478高效液相色譜系統，EMPOWER數據處理軟件;TDL-5-A高速離心機 (上海安亭科學儀器廠);DELTA320 pH計 (梅特勒公司);KL512J氮吹儀 (北京康林科技有限責任公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱為Dikma DIAMONDSIL C18 250 mm×4.6 mm不銹鋼柱;二元流動相，其中流動相A為甲醇，流動相B為0.8%乙酸水溶液;采用雙波長檢測，檢測波長分別為260 nm和210 nm;色譜柱溫40℃，采用梯度洗脫，洗脫梯度條件見表1。

1.4 樣品前處理方法

石蒜組織中植物內源激素提取和制備方法按以下操作流程進行:稱量切碎的石蒜樣品5.0 g于研缽中，加入液氮研磨至粉末，加入80%的冷甲醇和30 mg·mL-1抗氧化劑 (二乙基二硫代氨基甲酸)50 μL，在0～4℃的冰箱里放置過夜，將樣品和溶液轉入離心管，用10 mL甲醇洗滌研缽2次，于5 000 r·min-1離心，去掉殘渣取上清液，40℃氮吹至水相，將水相 pH調至6.4，加入0.5 g PVP，超聲30 min后于5 000 r·min-1離心，上清液pH調至2.9，用30 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40℃用氮吹儀吹干，用流動相溶解定容至2 mL，經0.45 nm微孔濾膜過濾，上機檢測。

表1 梯度洗脫流量和流動相比率變化

2 結果與分析

2.1 4種內源激素混合標樣分離譜圖

由圖1可見，各目標組分分離度較好，峰形對稱，響應值在合適范圍內，IAA的保留時間為10.60 min，AB的保留時間為12.5 min，GA3的保留時間為6.53 min，ZT的保留時間為3.5 min。

2.2 石蒜組織中4種內源激素測定圖譜

經過前處理的樣品，按設定的色譜條件進樣20 μL進行檢測，其譜圖如圖2。

圖1 4種內源激素混合標準溶液的色譜圖

從圖2可見，經過樣品前處理后的樣品雜質比較少，各組分的分離比較理想，可用于準確定量分析。

2.3 方法回收率實驗

通過在搗碎石蒜樣品中添加4種內源激素標樣，經過1.4樣品前處理過程，同時做樣品空白，通過檢測添加組分的含量，如添加量的比較，計算樣品的回收率，回收率結果詳見表2。

表2 樣品添加的回收率

從表2可知，回收率能達到了植物內源激素分析測定所要求。其中ZT的回收率偏低，這與其較易分解有關，而GA3回收率較高，可能是由于石蒜中類似物干擾造成。

圖2 石蒜組織中4種內源激素測定圖譜

3 小結和討論

由于植物樣品中富含多酚類、色素類、糖類等復雜基質造成定性和定量分析較為困難，石蒜中雖然不含色素，但含有多酚類和粘度較大的粘性物質，同時還存在許多與赤霉素類物質相近的雜質，給用HPLC法進行多種植物內源激素的分析帶來困難，對樣品前處理提出了比較高的要求。

樣品前處理的關鍵是盡可能地去除干擾雜質但又保證檢測目標的內源激素有較高回收率。通過適當加入了不溶性聚乙烯吡咯烷酮，盡可能減少樣品的損失和處理步驟。PVP是一種可通過氫鍵吸附多酚類和色素類雜質的物質，不溶性的PVP可通過攪拌和高速離心使被測物與吸附有雜質的PVP成功分開。Glenn等［7］采用PVP柱去除雜質，陳昆松等［8］采用抽濾方法去雜。本研究改為用高速離心法既可節約時間，又可同時進行多樣品的處理，而又不降低內源激素回收率。

儀器的檢測條件在已有文獻基礎上進行改進［9-10］。由于4種植物內源激素的最大吸收波長不同，其中IAA、ABA、ZT和 GA3的最大吸收波長分別為254，260，270和210 nm，由于相差比較遠，特別是GA3的吸收波長靠近石英玻璃和流動相中甲醇的吸收波長，所以單一波長檢測難以兼顧，必須選擇兩波長或多波長進行檢測。由于前3種目標物最大吸收波長比較接近，取其中間最大吸收波長260作為檢測波長，對GA3則采取其最大吸收波長210 nm單獨檢測。

本研究建立了可滿足石蒜中4種植物內源激素同時測定的樣品前處理方法和HPLC色譜檢測條件，實驗重演性好、回收率較高，而且相對現有的其他HPLC分析方法，本方法的操作時間大為縮短。

［1］ 鮑淳松，朱春艷，張海珍，等.施肥對長筒石蒜生長的效應研究 ［J］.浙江農業科學，2009(6):1092-1095.

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［3］ 李宗霆，周燮.植物激素及其免疫檢測技術 ［M］.南京:江蘇科學技術出版社，1996.

［4］ 李春儉.可擴散型吲哚乙酸的測定 ［J］.植物生理學通訊，1996，32(2):132-134.

［5］ 謝君.高效液相色譜測定多種植物內源激素分析方法［J］.四川農業大學學報，1997，15(3):297-299.

［6］ 陳建華，曹陽，李昌珠，等.板栗內源激素的高效液相色譜測定方法 ［J］.中南林學院學報，2004，5(24);40-42.

［7］ Glenn J L，Kuo C C，Durley R C，et a1.Use of insoluble polyvinylpyrrolidone for purification ofplant extracts and chromatography of plant hormones［J］. Phytochem，1972(11):345-351.

［8］ 陳昆松，徐昌杰，李方，等.HPLC法檢測果實組織中內源IAA、ABA方法的改進 ［J］，果樹學報，2003，20(1):4-7.

［9］ 于玉梅，劉春香，朱妍妍，等.高效液相色譜法在黃瓜果實內源激素測定上的應用及改進 ［J］.山東農業科學，2008(7):97-99.

［10］ 徐愛軍，高桂枝，湯莉莉.梯度洗脫測定植物源調節劑中內源激素方法探討 ［J］.分析試驗室，2007，9(26);51-54.