液相色譜梯度洗脫法檢測(cè)石蒜組織中4種內(nèi)源激素的方法

付曉陸，汪少敏，徐 敏

(1.浙江省余姚市農(nóng)技總站 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)站，浙江 余姚 315400;2.杭州植物園，浙江 杭州 310000)

石蒜屬 (Lycoris Herb)植物是著名球根花卉，被譽(yù)為中國(guó)郁金香。近年來(lái)，在城市道路綠化改造以及花園景點(diǎn)綠化改造提升中對(duì)石蒜的需求越來(lái)越多，但石蒜自然繁殖率低滿足不了市場(chǎng)需求，需通過(guò)組培快繁才能在短期內(nèi)達(dá)到規(guī)模化的種苗，而這需要測(cè)定石蒜組織中各激素的動(dòng)態(tài)變化為前提［1］。

植物的內(nèi)源激素與植物生長(zhǎng)發(fā)育的基本規(guī)律和代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)控制都密切相關(guān)，因此植物內(nèi)源激素的準(zhǔn)確測(cè)定，對(duì)植物生命活動(dòng)和作物遺傳育種栽培領(lǐng)域的研究具有重要的意義。植物內(nèi)源激素的檢測(cè)主要有氣相色譜法［2］、酶聯(lián)免疫法［3］、放射免疫法［4］和高效液相色譜法 (HPLC)［5-6］等。相對(duì)而言，HPLC法具有靈敏度高、專一性強(qiáng)和重復(fù)性好等特點(diǎn)，但HPLC定量分析要求上機(jī)檢測(cè)的樣品有相當(dāng)高的純度，要求必須有適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ǎ駝t會(huì)直接影響HPLC法的測(cè)定結(jié)果。不同植物材料的組分差異甚大，因而尚無(wú)一種通用的植物材料前處理方法。石蒜球莖中富含多酚類和赤霉素類似物等雜質(zhì)，如果前處理方法不當(dāng)，上機(jī)檢測(cè)的樣品雜質(zhì)含量過(guò)高，難以對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行有效的分離，造成定量困難，達(dá)不到檢測(cè)的目的。本方法是在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合石蒜組織組成的基本特點(diǎn)，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)不斷改進(jìn)總結(jié)，能滿足石蒜中IAA、ABA、ZT和GA3等4種植物內(nèi)源激素的分析的要求，方法具有定量準(zhǔn)確、能適應(yīng)復(fù)雜基質(zhì)干擾等特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料試劑

用于本方法研究的石蒜由杭州植物園提供;內(nèi)源激素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自SIGMA公司;聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)(國(guó)藥集團(tuán)試劑公司);二乙基二硫代氨基甲酸 (國(guó)藥集團(tuán)試劑公司)。

1.2 儀器和設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)采用的儀器為Waters2695/2478高效液相色譜系統(tǒng)，EMPOWER數(shù)據(jù)處理軟件;TDL-5-A高速離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠);DELTA320 pH計(jì) (梅特勒公司);KL512J氮吹儀 (北京康林科技有限責(zé)任公司)。

1.3 色譜條件

色譜柱為Dikma DIAMONDSIL C18 250 mm×4.6 mm不銹鋼柱;二元流動(dòng)相，其中流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.8%乙酸水溶液;采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為260 nm和210 nm;色譜柱溫40℃，采用梯度洗脫，洗脫梯度條件見(jiàn)表1。

1.4 樣品前處理方法

石蒜組織中植物內(nèi)源激素提取和制備方法按以下操作流程進(jìn)行:稱量切碎的石蒜樣品5.0 g于研缽中，加入液氮研磨至粉末，加入80%的冷甲醇和30 mg·mL-1抗氧化劑 (二乙基二硫代氨基甲酸)50 μL，在0～4℃的冰箱里放置過(guò)夜，將樣品和溶液轉(zhuǎn)入離心管，用10 mL甲醇洗滌研缽2次，于5 000 r·min-1離心，去掉殘?jiān)∩锨逡海?0℃氮吹至水相，將水相 pH調(diào)至6.4，加入0.5 g PVP，超聲30 min后于5 000 r·min-1離心，上清液pH調(diào)至2.9，用30 mL的乙酸乙酯萃取3次，合并酯相，40℃用氮吹儀吹干，用流動(dòng)相溶解定容至2 mL，經(jīng)0.45 nm微孔濾膜過(guò)濾，上機(jī)檢測(cè)。

表1 梯度洗脫流量和流動(dòng)相比率變化

2 結(jié)果與分析

2.1 4種內(nèi)源激素混合標(biāo)樣分離譜圖

由圖1可見(jiàn)，各目標(biāo)組分分離度較好，峰形對(duì)稱，響應(yīng)值在合適范圍內(nèi)，IAA的保留時(shí)間為10.60 min，AB的保留時(shí)間為12.5 min，GA3的保留時(shí)間為6.53 min，ZT的保留時(shí)間為3.5 min。

2.2 石蒜組織中4種內(nèi)源激素測(cè)定圖譜

經(jīng)過(guò)前處理的樣品，按設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣20 μL進(jìn)行檢測(cè)，其譜圖如圖2。

圖1 4種內(nèi)源激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

從圖2可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)樣品前處理后的樣品雜質(zhì)比較少，各組分的分離比較理想，可用于準(zhǔn)確定量分析。

2.3 方法回收率實(shí)驗(yàn)

通過(guò)在搗碎石蒜樣品中添加4種內(nèi)源激素標(biāo)樣，經(jīng)過(guò)1.4樣品前處理過(guò)程，同時(shí)做樣品空白，通過(guò)檢測(cè)添加組分的含量，如添加量的比較，計(jì)算樣品的回收率，回收率結(jié)果詳見(jiàn)表2。

表2 樣品添加的回收率

從表2可知，回收率能達(dá)到了植物內(nèi)源激素分析測(cè)定所要求。其中ZT的回收率偏低，這與其較易分解有關(guān)，而GA3回收率較高，可能是由于石蒜中類似物干擾造成。

圖2 石蒜組織中4種內(nèi)源激素測(cè)定圖譜

3 小結(jié)和討論

由于植物樣品中富含多酚類、色素類、糖類等復(fù)雜基質(zhì)造成定性和定量分析較為困難，石蒜中雖然不含色素，但含有多酚類和粘度較大的粘性物質(zhì)，同時(shí)還存在許多與赤霉素類物質(zhì)相近的雜質(zhì)，給用HPLC法進(jìn)行多種植物內(nèi)源激素的分析帶來(lái)困難，對(duì)樣品前處理提出了比較高的要求。

樣品前處理的關(guān)鍵是盡可能地去除干擾雜質(zhì)但又保證檢測(cè)目標(biāo)的內(nèi)源激素有較高回收率。通過(guò)適當(dāng)加入了不溶性聚乙烯吡咯烷酮，盡可能減少樣品的損失和處理步驟。PVP是一種可通過(guò)氫鍵吸附多酚類和色素類雜質(zhì)的物質(zhì)，不溶性的PVP可通過(guò)攪拌和高速離心使被測(cè)物與吸附有雜質(zhì)的PVP成功分開(kāi)。Glenn等［7］采用PVP柱去除雜質(zhì)，陳昆松等［8］采用抽濾方法去雜。本研究改為用高速離心法既可節(jié)約時(shí)間，又可同時(shí)進(jìn)行多樣品的處理，而又不降低內(nèi)源激素回收率。

儀器的檢測(cè)條件在已有文獻(xiàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)［9-10］。由于4種植物內(nèi)源激素的最大吸收波長(zhǎng)不同，其中IAA、ABA、ZT和 GA3的最大吸收波長(zhǎng)分別為254，260，270和210 nm，由于相差比較遠(yuǎn)，特別是GA3的吸收波長(zhǎng)靠近石英玻璃和流動(dòng)相中甲醇的吸收波長(zhǎng)，所以單一波長(zhǎng)檢測(cè)難以兼顧，必須選擇兩波長(zhǎng)或多波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。由于前3種目標(biāo)物最大吸收波長(zhǎng)比較接近，取其中間最大吸收波長(zhǎng)260作為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)GA3則采取其最大吸收波長(zhǎng)210 nm單獨(dú)檢測(cè)。

本研究建立了可滿足石蒜中4種植物內(nèi)源激素同時(shí)測(cè)定的樣品前處理方法和HPLC色譜檢測(cè)條件，實(shí)驗(yàn)重演性好、回收率較高，而且相對(duì)現(xiàn)有的其他HPLC分析方法，本方法的操作時(shí)間大為縮短。

［1］ 鮑淳松，朱春艷，張海珍，等.施肥對(duì)長(zhǎng)筒石蒜生長(zhǎng)的效應(yīng)研究 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(6):1092-1095.

［2］ 李玲，付種，郭紹川.溫度脅迫下雜交稻幼苗內(nèi)源ABA含量和電解質(zhì)滲透率變化 ［J］.植物生理學(xué)通訊，1994，30(2):103-105.

［3］ 李宗霆，周燮.植物激素及其免疫檢測(cè)技術(shù) ［M］.南京:江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，1996.

［4］ 李春儉.可擴(kuò)散型吲哚乙酸的測(cè)定 ［J］.植物生理學(xué)通訊，1996，32(2):132-134.

［5］ 謝君.高效液相色譜測(cè)定多種植物內(nèi)源激素分析方法［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，15(3):297-299.

［6］ 陳建華，曹陽(yáng)，李昌珠，等.板栗內(nèi)源激素的高效液相色譜測(cè)定方法 ［J］.中南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，5(24);40-42.

［7］ Glenn J L，Kuo C C，Durley R C，et a1.Use of insoluble polyvinylpyrrolidone for purification ofplant extracts and chromatography of plant hormones［J］. Phytochem，1972(11):345-351.

［8］ 陳昆松，徐昌杰，李方，等.HPLC法檢測(cè)果實(shí)組織中內(nèi)源IAA、ABA方法的改進(jìn) ［J］，果樹(shù)學(xué)報(bào)，2003，20(1):4-7.

［9］ 于玉梅，劉春香，朱妍妍，等.高效液相色譜法在黃瓜果實(shí)內(nèi)源激素測(cè)定上的應(yīng)用及改進(jìn) ［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(7):97-99.

［10］ 徐愛(ài)軍，高桂枝，湯莉莉.梯度洗脫測(cè)定植物源調(diào)節(jié)劑中內(nèi)源激素方法探討 ［J］.分析試驗(yàn)室，2007，9(26);51-54.