寧南山區本氏針茅自然種群遺傳分化的ISSR分析

俞 靚，井趙斌，魏 琳，程積民

（1.西北農林科技大學資源與環境學院，陜西 楊凌712100；2.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌712100；3.中國科學院水利部水土保持研究，陜西 楊凌712100）

典型草原是溫帶內陸半干旱氣候條件下形成的草地類型，針茅屬植物是構成其草原植被的重要組分［1］。在嚴重的人為干擾和惡劣的氣候影響下，作為建群種或優勢種的針茅屬植物大范圍衰退［2］，因此從物種保護角度對其遺傳多樣性和遺傳結構進行研究具有重要意義。目前，利用DNA分子標記對針茅屬植物的遺傳多樣性研究已有一些報道。趙念席等［3-6］、張慶等［7］和宋濤等［8］采用 RAPD 標記分別分析了內蒙古地區大針茅（Stipagrandis）和克氏針茅（S.krylovii）的遺傳分化，短花針茅（S.breviflora）的遺傳多樣性以及內蒙古中東部地區貝加爾針茅（S.baicalensis）的遺傳關系。但應用其他DNA分子標記對我國針茅屬植物遺傳多樣性的研究尚未見報道。

本氏針茅（S.bungeana）又名長芒草，是一種喜暖旱生叢生禾草，屬于禾本科針茅屬無毛芒組（Sect.Leiostipa Dum），是黃土高原典型草原的建群種和優勢種植物，同時也是治理水土流失、改善生態環境的優良草種，因其草質柔軟、營養豐富、適口性較好，又是牲畜較喜食的天然飼草［9］。近年來，黃土高原地區水土流失日趨嚴重，生態環境惡化，使得大面積的本氏針茅種群已不多見，因此，迫切需要對本氏針茅天然草原進行保護。

分子標記被認為是研究遺傳多樣性的最有效途徑，在各種DNA分子標記技術中，ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）分子標記技術，因其不具有物種特異性的特點［10］，目前被廣泛用于遺傳信息缺乏的牧草資源的遺傳多樣性研究中［11-15］。本研究對寧南山區6個本氏針茅種群的遺傳多樣性進行ISSR分析，旨在探討本氏針茅種群遺傳多樣性及遺傳變異產生的分子生態機理，以期為本氏針茅草原的合理利用和科學管理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 2010年7月中旬在寧夏回族自治區寧南山區，選取6個本氏針茅自然種群（均為典型草原，其他生境狀況詳見表1。在各種群內，隨機挑選20株植物，單株間距離不小于10m，每株剪取幼嫩、健康、無病斑葉片若干，編號裝袋，置冰盒中帶回實驗室，于-80℃條件下保存備用。

表1 采樣點的生境特征Table 1 Collected locations and habitat characteristics

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測 采用改良的CTAB法提取基因組DNA，經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計雙重檢測。將各樣品的基因組DNA工作液濃度用TE緩沖液稀釋至20ng·μL-1作為PCR模板，保存母液和工作液于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 引物篩選 引物選用加拿大哥倫比亞大學（University of British Columbia Biotechnology，UBC）公布的96個ISSR引物，由北京奧科生物工程公司合成。選取4個田間性狀表現差異較大的種群，每個種群內隨機選取一個單株，共計4個單株進行引物篩選，最終選取15個擴增產物條帶清晰、多態性高且重復性好的引物用于種群遺傳多樣性的分析，引物序列見表2［16］。

表2 本氏針茅ISSR分析的引物序列Table 2 Primer sequences used in ISSR analysis of Stipa bungeana

1.2.3 PCR擴增及產物的檢測 PCR擴增反應體系為：DNA 20ng、Taq DNA酶1U、dNTPs 0.18 mmol·L-1、引物0.75mmol·L-1、Mg2＋1.87、10×Buffer（100mmol·L-1Tris-HCl，pH 值8.3；500mmol·L-1KCl），不足體積的用ddH2O補充至20μL［17］。PCR擴增反應程序：第1階段，94℃預變性5min；第2階段共35個循環，首先94℃變性45s，然后退火45s（退火溫度因不同引物而定，表2），再者72℃延伸90s；第3階段，72℃延伸5 min；最后4℃保存［18］。

擴增產物經6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，用0.1%的AgNO3進行銀染，并在NaOH溶液中顯色，凝膠用高分辨率數碼相機拍照保存。

1.2.4 數據處理與分析 用人工讀帶的方法，選擇清晰可辨的擴增條帶進行統計，模糊不清的條帶忽略不計。按同一遷移位置上擴增產物的有無進行統計，擴增產物在相同遷移位置有帶賦值為“1”，無帶賦值為“0”，建立原始二元性狀數據矩陣，通過軟件DCFA 1.1［19］形成數據分析的原始文件，再依據不同的研究目的選取不同的軟件對數據進行分析［20］。

在假設種群內基因頻率處于Hardy-Weinberg遺傳平衡的前提下，利用POPGENE 1.32［21］軟件計算多態位點比率（PPB）、Nei’s基因多樣性（H）和Shannon信息指數（I）等遺傳多樣性指數，用于估算各種群間的遺傳多樣性，種群內和種群間的遺傳分化系數（φst）用軟件 AMOVA 1.55［21］計算。

利用POPGENE 1.32軟件，根據各條帶的出現頻率計算各種群間的遺傳距離（D）和遺傳一致度（I），并用非加權配對算術平均法（UPGMA）對各種群間遺傳距離進行聚類分析，經POPGENE軟件1 000次重抽樣構建聚類圖。

利用Pearson相關分析（SPSS 16.0）的方法計算各種群遺傳多樣性指數與生態因子間（海拔、經度、緯度、年均溫和年降水量）的相關系數。

利用R語言對各種群間的遺傳距離矩陣（POPGENE軟件計算所得）與實際地理距離矩陣進行Mantel檢驗，以檢驗遺傳距離與實際地理距離之間的相關性［22］。

2 結果

2.1 本氏針茅的遺傳多樣性 15條ISSR引物在6個本氏針茅種群的120個單株中共擴增出244條清晰的條帶，擴增的DNA片段大部分集中在100～2 000bp（圖1），其中多態性條帶239條，多態性位點比率（PPB）為97.95%，Nei’s基因多樣性（H）為0.254 4，Shannon信息指數（I）為0.396 6。在6個種群中，A2種群的遺傳多樣性最高（PPB＝68.44%，H＝0.213 2，I＝0.324 4），而 A6種群的遺傳多樣性最低（PPB＝41.39%，H＝0.111 7，I＝0.173 4）（表3）。

2.2 本氏針茅的群體遺傳結構 本氏針茅種群的遺傳變異通過POPGENE軟件分析得出，其種群總遺傳多樣性Ht＝0.254 4，種群內遺傳多樣性Hs＝0.157 9，種群間遺傳多樣性 Dst＝0.096 5（Dst＝Ht-Hs），基因分化系數 Gst＝0.399 6。結果表明，種群間的遺傳變異較低于種群內的遺傳變異，分別占總遺傳變異的39.96%和60.04%。

分子變異方差分析（AMOVA）結果表明（表4），種群間的變異方差分量為16.142 6，種群內不同個體間的方差分量為22.346 1，遺傳分化系數φst＝0.419，表明本氏針茅種群的變異是由不同種群（遺傳變異為41.90%）和種群內個體（遺傳變異為58.06%）共同提供，即種群間的變異和種群內不同個體的變異共同構成了群體的遺傳差異，貢獻都達到了極顯著（P＜0.001）。上述結果與POPGENE的分析結果基本一致，均表明本氏針茅的遺傳變異主要存在于種群內，種群間的遺傳變異較小。

圖1 引物UBC834對部分本氏針茅材料的ISSR擴增圖譜Fig.1 ISSR fingerprints of some Stipa bungeana amplified with Primer UBC834

表3 6個本氏針茅種群的遺傳多樣性指數Table 3 Genetic diversity indexes of six populations of Stipa bungeana

2.3 種群間遺傳關系及聚類分析 基于Nei氏遺傳一致度和遺傳距離可進一步分析種群間的遺傳分化程度［23］。本氏針茅6個種群中（表5），A3與A4間遺傳一致度最高，為0.977 7，相應的遺傳距離最小，為0.022 5；而A1與A6間遺傳一致度最低，為0.706 1，遺傳距離最遠，為0.347 9，說明A3與A4種群間的關系最近，A1與A6種群間的關系最遠。

利用UPGMA法建立的系統樹可以直接反映植物種內、種間或居群間的關系［24］，因此對本氏針茅種群的Nei’s遺傳距離構建遺傳關系聚類圖（圖2）。此聚類圖表明，6個自然種群聚成4支：A3和A4種群聚成一支；A5和A6種群聚成一支；A1和A2種群各聚成一支。

根據6個種群間的遺傳距離矩陣值和地理矩陣值的Mantel檢測結果（圖2），在1 000次置換中，各種群間的遺傳距離大小和地理距離遠近均無顯著相關性（r＝-0.156 9，P＝0.733＞0.05），說明引起本氏針茅種群分化的主要原因不是地理距離的遠近。

表4 本氏針茅種群的分子變異方差分析（AMOVA）Table 4 Analysis of molecular variance（AMOVA）of Stipa bungeana populations

表5 本氏針茅種群遺傳一致度和遺傳距離Table 5 Genetic similarity coefficient and genetic distance of Stipa bungeana

圖2 基于本氏針茅種群間Nei’s無偏差遺傳距離構建的UPGMA聚類Fig.2 Dendrogram generated by UPGMA based on Nei’s unbiased genetic distances among Stipa bungeana populations

2.4 遺傳多樣性指數與生態因子之間相關性分析 對本氏針茅種群ISSR標記的遺傳多樣性指數與其所在生境的生態因子進行Pearson相關分析，結果表明，ISSR標記的遺傳多樣性指數與其所處生境的生態因子均未達到顯著相關水平（表6），表明本氏針茅生境環境因子對本氏針茅的遺傳多樣性變化沒有顯著影響。

3 討論

3.1 本氏針茅的遺傳多樣性 遺傳多樣性一般是指種內遺傳多樣性，即遺傳特性的差異程度，用于評價某物種與其環境的相互作用方式及被改造和利用的潛力［23］。本研究利用ISSR分子標記對寧南山區6個本氏針茅自然種群120個單株材料進行PCR擴增，采用3種遺傳多樣性參數（多態性位點比率、Nei’s基因多樣性和Shannon信息指數）對其遺傳變異進行了分析。本氏針茅各種群的多態性位點比率在41.39%～68.44%，總多態性位點比率為97.95%。這可能是由于有些位點僅在個別群體中表現出多態或只在個別群體中可檢測到，這些位點在各群體中分布的不均衡，導致總多態性位點比率很高［25］。一般認為，多態性位點比率在50%左右時，植物的遺傳多樣性是豐富的［26-28］。就多態性位點比率來看，本氏針茅種群具有較高的遺傳多樣性，但是，多態性位點比率簡單直觀，會受樣本大小和條帶總數的影響，且不能反映各條帶的頻率變化，對遺傳多樣性的評價只能是一個粗略的估計值［28］。因此，基于Hardy-Weinberg假設的Nei’s基因多樣性和基于條帶表型頻率Shannon信息指數能更準確的評價種群遺傳多樣性［29］。本氏針茅種群Nei’s基因多樣性（H＝0.254 4）明顯高于單子葉植物的平均值（H＝0.190 0）［30］，這個結果也說明本氏針茅種群具有較高的遺傳多樣性。在野外調查和取樣的過程中發現，本氏針茅產生種子的能力并不低，但最后能萌發成實生苗的種子比例卻較小。朱桂林等［31］發現針茅屬植物的有性繁殖與水分因子密切相關，水分條件好，實生苗存活率高，有性繁殖能力強。在黃土高原惡劣的生境中，本氏針茅主要是以珠芽進行營養繁殖的。趙慶芳等［32］研究發現，種群內較高的遺傳多樣性可由補充較低比例的實生苗來維持。因此，寧南山區本氏針茅種群遺傳多樣性較高的主要原因可能與實生苗的不斷補充有關。

表6 本氏針茅種群遺傳多樣性指數與生態因子之間的Pearson相關性Table 6 Pearson correlation analyses for the relationships between genetic diversity indexes and ecological factors of Stipa bungeana

圖3 6個本氏針茅種群間遺傳距離與地理距離的相關關系Fig.3 The correlation between geneticdistance and geographic distance for six populations of Stipa bungeana

3.2 本氏針茅的遺傳分化 群體遺傳結構是指一個物種或群體的遺傳變異在空間的非隨機分布式樣，即群體內、群體間的分布式樣以及在時間上的變化，在很大程度上代表了其進化潛力［33］。因此，確定物種群體的遺傳結構，有利于了解其生物學特性、探討其進化過程和機制。群體遺傳分化是衡量遺傳結構的重要指標，表示種群間的變異占總的遺傳變異中的比例［34］。利用分子方差變異AMOVA分析對本氏針茅種群的遺傳結構進行分析，其遺傳分化系數達到0.419，明顯大于單子葉植物（Gst＝0.231）和多年生草本植物（Gst＝0.233）［35］，說明本氏針茅種群發生了較大程度的遺傳分化，其遺傳變異主要存在于種群內，種群間的遺傳變異相對較小。

Hamarick和 Godt［35］報道，植物的繁育系統、種子擴散機制、繁殖方式以及自然選擇等因素對其遺傳特征產生很大影響。作為典型的風媒傳粉植物，本氏針茅的花粉和種子的傳播與擴散無疑會影響其遺傳分化。本研究的野外調查和取樣生境為寧南山區，位于黃土高原半干旱區的典型草原，雖秋季多強風，但地形復雜，致使種子和花粉遠距離傳播受阻。另外，本氏針茅是牲畜所喜食的放牧型牧草，其春季萌發較早，在其他牧草尚未生長時就被牲畜大量采食，很難形成一個集中的高活力種子庫，且無法依靠牲畜攜帶進行遠距離傳播。因此，本氏針茅種群內的遺傳變異大于種群間的遺傳變異的主要原因是種子無法遠距離傳播。

在對風媒植物的遺傳分化研究中，許多學者認為［36-37］，當種群間的遺傳距離與地理距離之間不存在顯著相關時，影響種群間遺傳分化的主要因素則是遺傳漂變或自然選擇，而不是遷移或基因流。本研究中Mantel檢驗結果顯示，在6個本氏針茅種群中，任意種群間的遺傳距離和地理距離均沒有顯著的相關關系（P＝0.733）。Volis等［38］曾認為，種群間的遺傳分化與氣候因子之間存在顯著相關關系的關鍵就在于種群間的遺傳分化是否因其遺傳漂變引起。本研究中，來源于不同地理類群的本氏針茅，其遺傳多樣性指數與其不同生境的若干氣候因子均未達到顯著相關關系。綜上所述，引起寧南山區本氏針茅種群間遺傳分化較大的原因可能是由種子與花粉傳播受阻以及遺傳漂變。

3.3 種群保護措施 在黃土高原半干旱區特殊的生境中，本氏針茅有性繁殖能力較弱，以珠芽的營養繁殖為主，因此，一方面要采取相應的科學保護管理措施，加強對其原生境的保護，防止人為干擾，阻止種群遺傳多樣性的衰敗；另一方面要加強對本氏針茅種子繁殖系統的深入研究，提高其在自然生境中的萌發力，以保護野生種質資源的可持續利用。

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