固定化銅綠假單胞菌生物降解對硝基苯酚

黃強，張明強

1.廈門大學嘉庚學院，福建 漳州 363105

2.漳州師范學院化學與環境科學系，福建 漳州 363000

硝基芳香族化合物作為重要的化工原料，廣泛用于醫藥、染料、農藥、塑料等行業，其在生產和使用過程中被釋放到環境中，會對生態系統造成危害［1］，目前對含該類化合物的廢水處理成為國內外學者的研究熱點之一。對硝基苯酚(p-nitrophenol，PNP)是一種重要的環境污染物，已被我國列入水中優先控制污染物黑名單［2］，治理該類化合物對保證人類健康具有重要意義。對硝基苯酚類廢水的處理方法有氧化還原法［3-4］、吸附法［5-6］和生化法［7-10］。利用生化法處理PNP廢水具有效率高、成本低的優勢。國外對其生物降解的研究已有較長的時間［11］，但是不同微生物的降解速度各不相同，分離不同的PNP降解菌株對研究PNP的生物降解機制具有重要的意義，其能為PNP污染的生物修復提供優良的材料。

固定化細胞技術作為現代化生物工程技術，是利用物理或化學手段將游離細胞定位于限定的空間領域，并使其保持活性，反復利用。與游離細胞方法相比，固定化技術克服了細胞太小，與水溶液分離較難，易造成二次污染等弊端，具有菌體密度高、反應迅速、菌體流失少、產物易分離、反應過程易控制等優點，是一種很有前途的污染物處理技術［12］。細胞被固定化后，細胞內酶系保存完整，相當于一個多酶生物反應器，可使反應更加充分徹底，所以固定化細胞技術被廣泛應用［13-14］。

筆者采用海藻酸鈉作細胞固定化的載體，以漳州某污水處理廠活性污泥中分離的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為固定化對象，研究了pH、溫度、PDP初始濃度等對固定化細胞生物降解PNP效果的影響，并比較了游離細胞與固定化細胞在生物降解PNP過程中的活性。

1 材料與方法

1.1 試劑

試驗所用PNP為化學純試劑，其他各種藥劑均為分析純試劑。

無機鹽培養液:(NH4)2SO4，1.0 g/L;K2HPO4，0.7 g/L;KH2PO4，0.3 g/L;MgSO4，0.2 g/L;NaCl，0.5 g/L;加入適量的PNP作為唯一碳源。

無碳無氮培養液:K2HPO4，0.7 g/L;KH2PO4，0.3 g/L;MgSO4，0.2 g/L;NaCl，0.5 g/L;加入適量的PNP作為唯一碳源和氮源。

富集培養基:蛋白胨，5 g/L;牛肉膏，3 g/L;NaCl，5 g/L。pH 為 7.4，121 ℃高壓滅菌 20 min，該培養基用于菌株的擴大培養。

1.2 儀器與設備

UV-2102PC紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器廠);SHA-B恒溫振蕩器(常州國華科技儀器有限公司);TGL-16G臺式離心機(上海浦東物理光學儀器廠);Sartorius電子天平(德國賽多利斯集團);AIR TECH超凈工作臺(北京格瑞恩科技發展有限公司);LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海中安醫療器械廠);PYX-250s-B生化培養箱(海口博艾森科技開發有限公司);Sartorius PB-10酸度計(德國賽多利斯集團);ML-902定時恒溫磁力攪拌器(上海五相儀器儀表有限公司)。

1.3 菌種

P.aeruginosa從漳州某污水處理廠的活性污泥中分離獲得，并鑒定保存。

1.4 分析項目

PNP濃度:取生物降解后的PNP培養液4 mL，12000 r/min離心10 min，取上清稀釋一定倍數，用1 mol/L的HCl調pH為4.0，用紫外分光光度計掃描(200～400 nm)，觀察特征峰(317 nm)的消失，并用標準曲線法計算PNP濃度及降解率(η):

式中，C0和C分別為降解前后PNP濃度，mg/L。

吸光度(A):采用紫外分光光度計在波長為600 nm下進行檢測，以初始培養液(未接菌懸液時)為空白參比。

亞硝酸根采用對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺比色法［15］測定。

以上各試驗均做3組平行試驗，數值為3組平行試驗結果的平均值。

1.5 試驗方法

1.5.1 菌懸液的制備

將P.aeruginosa菌株活化并擴大培養，收集對數生長期［16］的濕菌體，8‰生理鹽水洗滌后，以8000 r/min速度離心10 min，收集菌泥，將其制備成濃度為80%的菌懸液。

1.5.2 固定化細胞的制備

以海藻酸鈉為載體，采用包埋法［17］制備固定化細胞，并通過正交試驗優化固定化細胞的制備條件。按1 g菌懸液加入10 mL海藻酸鈉膠液的比例充分混合均勻制成菌膠混合液，用直徑為1.5 mm針頭將菌膠混合液滴入4℃連續攪拌的30 mL CaCl2溶液中，形成凝膠顆粒，在4℃交聯鈣化一定時間后，得到直徑為3～4 mm的固定化小球，該小球用8‰生理鹽水洗滌2次，即可以使用。

1.5.3 固定化細胞的PNP生物降解試驗

研究了pH、溫度、PNP初始濃度對PNP生物降解效果的影響，并通過菌株生長曲線、降解時間動力學曲線及降解產物的測定，分析P.aeruginosa菌株的固定化細胞降解PNP的能力及活性。

2 結果與討論

2.1 菌種生長周期測定

菌種的生長周期對菌株的固定化非常重要。圖1為P.aeruginosa菌株的生長曲線。由圖1可知，菌株在培養9 h后開始進入對數生長期，約22 h進入生長平衡期。因此，對該菌種進行固定化時，應選擇其對數生長期(9～22 h)的種液，以保持其最高活性。

圖1 P.aeruginosa菌株生長曲線Fig.1 The growth curve of bacterium Pseudomonas aeruginosa

2.2 正交法優化細胞固定化的最佳條件

影響固定化細胞降解效果的因素主要有包埋的菌體量、海藻酸鈉膠液濃度、CaCl2濃度以及交聯鈣化時間。采用正交試驗法，進行四因素三水平L9(34)正交試驗［18］(表 1)，以 PNP 的降解率為指標進行最佳制備條件的確定。

表1 固定化細胞正交試驗設計Table 1 Factors and levels of the cross-test experiments

按表1的因素和水平，采用1.5節方法制得9組固定化細胞(各組海藻酸鈉膠液均為10 mL)，分別加入初始濃度為50 mg/L的PNP培養液25 mL，調節pH為8.0，培養溫度30℃，120 r/min旋轉搖床振蕩42 h，測定PNP的降解率，結果如表2和表3所示。

表2 試驗數據分析Table 2 Analysis of the experimental data

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

從表2和表3可以看出，各因素水平的最優組合為A3B2C1D3。即每mL海藻酸鈉包埋的菌體量為0.3 g，海藻酸鈉膠液濃度為3%，CaCl2濃度為4%，交聯鈣化時間為12 h。

2.3 pH的影響

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞和與之菌量相等的濕菌體(游離細胞)分別接種于25 mL初始濃度為100 mg/L的PNP無機鹽培養液中，調節pH 分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0，培養溫度30℃，120 r/min旋轉搖床振蕩40 h，測定 PNP濃度，結果如圖2所示。

圖2 pH對PNP生物降解性能的影響Fig.2 Effect of pH on the performance of degrading PNP

考察pH對固定化細胞降解PNP效果影響的同時，還應考慮pH對固定化載體牢固程度的影響。當培養液pH調至10.0以上時，固定化載體的牢固程度下降，載體部分溶解。由圖2可知，與游離細胞相似，固定化細胞降解PNP的最適pH為8.0～9.0。在各pH范圍內，固定化細胞對PNP的降解能力均好于游離細胞。

2.4 溫度的影響

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞和與之菌量相等的濕菌體(游離細胞)分別接種于25 mL初始濃度為50 mg/L的PNP無機鹽培養液中，調節pH為8.0，培養溫度分別為 20、25、30、35、40 ℃，120 r/min旋轉搖床振蕩40 h，測定PNP濃度，結果如圖3所示。

圖3 溫度對PNP生物降解性能的影響Fig.3 Effect of temperature on the performance of degrading PNP

考察溫度對PNP生物降解活性的影響，對探討該方法在不同環境溫度的應用具有重要意義。由圖3可知，在不同的溫度下，固定化細胞對PNP的生物降解能力均好于游離細胞。與游離細胞相似，固定化細胞降解PNP的最適溫度為30～35℃。

2.5 PNP初始濃度的影響

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞和與之菌量相等的濕菌體分別接種于PNP初始濃度為25、50、100、150、200、250、300 和 350 mg/L 的 25 mL 無機鹽培養液中，調節pH為8.0，培養溫度為30℃，120 r/min旋轉搖床振蕩40 h，測定PNP濃度，結果如圖4所示。

由圖4可知，當PNP初始濃度為350 mg/L時，游離細胞的降解率接近于0，而固定化細胞的降解率為4.35%。與游離細胞相比，固定化細胞降解PNP耐受濃度有一定幅度的提高，這是由于在固定化系統中，PNP需擴散進入載體內部，才能被包埋在載體內的微生物細胞分解［19］。擴散作用使PNP濃度從載體外部到內部由高到低，形成濃度梯度［15］，減輕了PNP對載體內菌株的毒性，利于菌株對PNP的降解，并可加強其對PNP毒性的耐受力。

圖4 PNP初始濃度對生物降解性能的影響Fig.4 Effect of different initial PNP concentration on PNP degradation

2.6 固定化細胞降解PNP的動力學曲線

將P.aeruginosa菌株的固定化細胞接種于初始濃度為50 mg/L的PNP無機鹽培養液中，調節pH為8.0，培養溫度為30℃，120 r/min旋轉搖床振蕩培養，進行固定化細胞降解PNP的時間動力學觀察，結果如圖5所示。

圖5 固定化細胞降解PNP的時間動力學曲線Fig.5 Kinetic curve of degradation of PNP by immobilized cells

由圖5可知，游離細胞與固定化細胞在PNP降解初期均有一段延滯期，游離細胞的延滯期約為38 h，固定化細胞的延滯期約為35 h。這是因為PNP對菌株的生長有抑制作用，即使是馴化后的菌株放入反應體系，也有一段適應期，所以在開始的一段時間PNP的降解速率很慢。而載體對于提高菌株的抗沖擊能力具有一定的作用，所以固定化細胞的延滯期縮短。

固定化細胞的降解曲線分為0～35和35～42 h兩段。隨著菌株生長的開始(35～42 h)，PNP迅速被生物降解，約7 h生物降解完全結束。

將上述固定化細胞再次利用，在同樣條件下生物降解PNP，其時間動力學曲線如圖6所示。由圖6可知，再次利用的固定化細胞，延滯期縮短為2 h，且生物降解速度明顯升高，約6 h生物降解完全結束。

圖6 再次利用固定化細胞降解PNP的時間動力學曲線Fig.6 Kinetic curve of degradation of PNP by reused immobilized cells

試驗表明，固定化細胞連續使用3次效果穩定。當固定化細胞第4次利用時，載體的機械強度變差，固定化小球破裂。這可能是由于固定的菌株產生能分解海藻酸鈉的酶，有待進一步探討。

2.7 生物降解產物鑒定

采用對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺比色法鑒定PNP生物降解后的產物，結果表明，經生物降解后的溶液中存在中間代謝產物NO2-。當在無氮無碳培養基中加入PNP進行培養時，P.aeruginosa菌株的固定化細胞可利用釋放的NO2-作為氮源進行生長。

3 結論

(1)采用正交法制備P.aeruginosa菌株固定化細胞，其最佳操作條件:每mL海藻酸鈉包埋菌懸液量為0.3 g;海藻酸鈉膠液濃度為3%;CaCl2濃度為4%;交聯鈣化時間為12 h。

(2)P.aeruginosa菌株固定化細胞對PNP的降解速度大于游離細胞，固定化細胞對PNP的耐受濃度比游離細胞高，這可能是由于在固定化系統中，擴散作用使PNP濃度從載體外部到內部由高到低，形成濃度梯度，減輕了PNP對載體內菌株的毒性，有利于菌株對PNP的生物降解，并可以加強其對PNP的耐受能力。

(3)P.aeruginosa菌株的固定化細胞隨著外界pH的增加，對PNP的降解率逐漸增大，但當pH大于10.0，固定化載體會出現部分溶解，因此其生物降解的最適pH為8.0～9.0。此外，與游離細胞相似，固定化細胞降解PNP的最適溫度為30～35℃。

(4)游離細胞與固定化細胞在生物降解初期均有一段延滯期，游離細胞的延滯期約為38 h，固定化細胞的延滯期約為35 h。這是因為載體對于提高菌株的抗沖擊能力具有一定的作用，所以固定化細胞的延滯期縮短。

(5)采用對氨基苯磺酸-鹽酸萘乙二胺比色法鑒定PNP生物降解后的產物，結果表明，經生物降解后的溶液中存在中間代謝產物NO2-，這說明在無添加氮的情況下，P.aeruginosa菌株的固定化細胞可利用釋放的NO2-作為氮源進行生長。

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