低濃度乙二胺四乙酸對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響*

郭志華，胡婷婷，單玲玲

(宿州學院化學與生命科學學院，安徽宿州，234000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引發食源性疾病的常見致病菌，廣泛存在于空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中，對食品安全構成嚴重威脅［1］。

生物被膜是指細菌附著在生物的或非生物的接觸面生長，分泌多糖、蛋白質等多聚化合物構成胞外基質，將其自身包裹其中而形成的大量微生物聚集體［2］。生物被膜中的細菌，尤其是處于深層的細菌，生物化學特性和形態結構均與浮游(planktonic)細菌不同，增殖和生長緩慢，對各種化學藥物(包括殺菌劑)的耐受性更高［3］。被膜態的金黃色葡萄球菌具有普遍存在、難發現和難去除等特點，其抗藥性遠高于浮游態的金黃色葡萄球菌。美國國立衛生研究院(NIH)指出，人類細菌性感染約有65%是由生物被膜引起的［4］。因此食品工業中生物被膜的形成對食品安全的威脅是不容忽視的，而當前對它的研究主要集中在醫學領域，食品工業領域涉及較少。

乙二胺四乙酸(EDTA)，是人工合成螯合劑，能和許多陽離子在一起形成復合物，在食品行業被廣泛用作穩定劑和螯合劑，它具有抑菌作用、限制生長必需的陽離子、破壞細菌細胞膜中的二價配合物等功能，可作為防腐劑使用。然而關于EDTA在細菌生物被膜中的影響的研究還很少，大部分的研究集中在EDTA作為抗菌劑防止致病菌污染導尿管。這些研究用的是高濃度的EDTA，通過抑制生長來抑制生物被膜的形成，或通過EDTA的螯合特性的殺菌效果根除成熟的生物被膜［5］。

本研究報道低濃度的EDTA可抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，對低濃度EDTA在食品加工過程中單獨或和其它化學物質結合使用，防止金黃色葡萄球菌生物被膜的形成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料儀器

1.1.1 菌種及培養

菌株:金黃色葡萄球菌，購于安徽農業大學。

培養基:胰蛋白胨大豆肉湯(TSB:青島高科海博生物技術有限公司)。

1.1.2 主要試劑

EDTA(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。其余試劑均為國產化學純。

1.1.3 儀器與設備

MULTISKAN GO酶標儀，美國 Thermo;BBSSDC-A超凈工作臺;AL204分析天平;SHP-250型生化培養箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 微孔板法分析生物被膜的形成

微孔板上生物被膜形成定量分析方法見文獻［6］。無菌的96孔PVC微孔板每孔中加入100 μL的TSB培養基，并接入10 μL過夜培養的新鮮菌液，蓋上蓋子，37℃培養36 h。培養結束，移出培養液，微孔板用蒸餾水洗滌3次，去除結合松散的浮游細菌，吸附緊密的細菌細胞用100 μL的甲醇固定15 min，移除甲醇，微孔板室溫晾干，每孔加入100 μL 1%的結晶紫溶液，在室溫中染色5 min，移除剩余的染液，并用蒸餾水沖洗板子直到滴水無色為止。隨后，微孔板在37℃孵育30 min，徹底干燥之后，加入200 μL 33%(體積比)的冰乙酸溶解吸附的細胞，從每個孔中吸出100 μL到新的微孔板中，用酶標儀測定630 nm處的吸光度值(OD)。所有的生物被膜的檢測均平行進行3次，每孔讀取3次讀數，并計算相應實驗的平均值和標準方差。

1.2.2 EDTA影響生物被膜形成的實驗

1.2.2.1 EDTA濃度的影響

用無菌的EDTA制作原始溶液(100 mmol/L，pH 7.0)。在轉接的開始，將EDTA加入到TSB培養基中，EDTA 最終濃度分別為 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 mmol/L，用來評價每個 EDTA 濃度對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響。

1.2.2.2 培養時間的影響

在不同的培養期額外加入EDTA，評價EDTA加入時間對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響。

準備有EDTA和無EDTA的TSB培養基，“階段轉變實驗”評價EDTA在生物被膜形成不同階段的作用。無菌的96孔PVC微孔板孔中加入100 μL有EDTA和無EDTA的TSB培養基，并接入10 μL過夜培養的新鮮菌液，蓋上蓋子，37℃培養16 h(階段1)，去除孔中浮游的細菌，每孔清洗3遍，加入100 μL添加EDTA和沒EDTA的TSB培養基，接著培養32 h(階段2)，經過共48 h的培養，檢測生物被膜。

此外，本試驗做了在有EDTA和無EDTA的TSB培養基中金黃色葡萄球菌的生長曲線。

1.2.2.3 金屬離子的影響

為研究在金屬螯合劑EDTA與二價金屬陽離子相互作用對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響，在TSB 中分別加入 Mg2+、Fe2+、Ba2+、Ca2+，接種金黃色葡萄球菌，培養36h后測定生物被膜情況。

1.2.2.4 EDTA消除成熟的生物被膜的研究

在不含EDTA的TSB培養基中接入新鮮金黃色葡萄球菌，PVC96微孔板上37℃培養36 h生成生物被膜。去除培養液，清洗3遍，去除松散的菌體，每孔加入含有不同濃度EDTA的PBS溶液，37℃培養36 h，測生物被膜情況。

1.2.2.5 聚集實驗［7］

聚集實驗在試管中進行，金黃色葡萄球菌接種在5 mL添加EDTA和無EDTA的TSB液體培養基中，37℃培養36h，培養結束后小心吸取上層溶液，測OD600，其余的經渦輪振蕩后，取菌懸液，測OD600。

2 結果與分析

2.1 EDTA濃度對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

EDTA對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響由圖1。隨著EDTA濃度的增加，生物被膜的生成量逐漸下降，到0.2 mmol/L時下降量基本趨于穩定，EDTA對金黃色葡萄球菌生物被膜形成最小抑制濃度為0.2 mmol/L，抑制率可達32%。0.2 mmol/L EDTA抑制生物被膜形成的能力與無EDTA相比存在顯著差異(P＜0.01)，說明低濃度EDTA能夠抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，這與文獻報道結果一致，抑制作用與EDTA添加濃度有關［5］。

圖1 EDTA濃度對生物被膜的影響

2.2 EDTA加入時間時間對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

為確定EDTA影響生物被膜生成的哪個階段，在整個生長階段的0、5、10、15、20、25、30、35、40 h 分別加入EDTA，使其最終濃度為0.2 mmol/L，結果見圖2。表明在零時間加入EDTA對生物被膜形成抑制作用最好。隨著時間的延長，加入EDTA對生物被膜形成的影響就越小。因此推斷EDTA只影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的早期階段。這一假設被“階段轉變實驗”證實。“階段轉變實驗”第1階段和第2階段相比無顯著性差異(P＞0.05)，EDTA在早期的出現會抑制生物被膜的形成，在第2階段加入EDTA不能影響生物被膜的形成。這些數據表明，EDTA只能影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的早期階段。生物被膜的形成可分為3步:細菌在接觸表面的吸附、微菌落的發育、包被多糖蛋白質復合物的成熟被膜的形成，不同階段具有不同的生理特性［8］。本研究的結果表明，EDTA可能從開始就影響金黃色葡萄球菌在接觸面的吸附，從而抑制生物被膜的形成。

2.3 EDTA對金黃色葡萄球菌生長的影響

圖2 EDTA加入時間對生物被膜的影響

為了進一步研究EDTA抑制生物被膜的作用機理，我們把金黃色葡萄球菌在有或無EDTA的TSB培養基中培養，每隔3 h測OD600，獲得的生長曲線如圖3所示。沒有EDTA時金黃色葡萄球菌由接種到33 h細胞數量增加到最高值，33 h后細胞的生長處于衰亡期，有一部分菌體就開始死亡。而加入EDTA后，菌體的生長受到抑制。這表明生物被膜的抑制可能與生長受到抑制有關。EDTA在濃度為0.2 mmol/L時，不僅可抑制生物被膜的形成，而且具有抑制金黃色葡萄球菌生長的作用。劉劍等人在研究EDTA對變異鏈球菌生長抑制和抗黏附作用研究中發現，EDTA對變異鏈球菌的最低抑菌濃度為0.5 mg/mL，約為 1.71 mmol/L［9］。

圖3 金黃色葡萄球菌在有或無EDTA的生長曲線

2.4 金屬離子與EDTA混合對金黃色葡萄球菌生物被膜的影響

不同金屬離子與EDTA混合對金黃色葡萄球菌生物被膜形成有不同的影響(圖3)，EDTA-Fe、EDTACa、EDTA-Mg混合后生物被膜的量有一定的增加，與無EDTA相比，有顯著性差異(P＜0.01)，說明Fe2+、Ca2+、Mg2+可以阻斷EDTA抑制生物被膜的效應。但是EDTA-Ba混合后生物被膜量變化不大，與無EDTA相比，無顯著性差異(P＞0.05)，Ba2+不能完全阻斷EDTA抑制生物被膜生成。這與文獻報道一致，Ehud Banin［10］研究不同二價金屬離子對EDTA抑制綠膿桿菌生物被膜形成的效應發現，Ba2+沒有影響EDTA的抑制效應;Mg2+沒有完全阻斷EDTA的抑制效應;但Fe2+、Ca2+可完全阻斷EDTA的抑制效應。對于綠膿桿菌，加入Ca2+，可增加生物被膜的粘結性，減少菌的分散。Chen［11］等認為，Fe2+產生的靜電作用有助于生物被膜的粘性，Fe2+和Ca2+可穩定生物被膜。

圖4 金屬離子與EDTA混合對生物被膜的影響

2.5 EDTA消除成熟的生物被膜的研究

為了研究EDTA對已生長成熟的金黃色葡糖球菌生物被膜是否有影響，把EDTA加入金黃色葡糖球菌已成熟的生物被膜溶液中培養36 h，統計分析結果顯示，每個EDTA濃度與無EDTA之間沒有統計學差異(P＞0.05)，EDTA不能破壞已經形成的生物被膜，即使是高濃度的EDTA也不能影響成熟的細胞被膜數量。

圖5 EDTA對成熟生物被膜的影響

2.6 聚集實驗

因為生物被膜是在細胞-表面和細胞-細胞之間形成的，因此要評估EDTA對這兩種相互作用的影響。上述的研究是在PVC微孔板中進行的，以了解EDTA在細胞-表面相互作用的影響。通過研究，EDTA可抑制金黃色葡萄球菌在PVC上生物被膜的形成。當培養基中沒有EDTA時，聚集的百分比為86%;培養基中有0.2 mmol/L EDTA時，聚集百分數降到30%。聚集的形成說明細胞之間有粘附作用，加入EDTA后減少聚集的形成，說明EDTA能抑制細胞之間的粘附作用。

3 討論

相較于其他細菌，能夠形成生物被膜的細菌更耐消毒劑和清洗。因此，抑制生物被膜的形成和根除生物被膜具有特殊意義。實驗中研究了低濃度EDTA對金黃色葡萄球菌在PVC上產生生物被膜的影響。

低濃度的EDTA可抑制金黃色葡萄球菌產生生物被膜，而且是在生物被膜形成的早期就可形成影響。EDTA可作食品添加劑加入食品中用來防腐，國家標準使用的濃度為0.075 g/kg，約0.668 mmol/L。實驗證實，0.2 mmol/L的EDTA就可以抑制生物被膜的形成，遠低于國家標準，可減少原料浪費。

實驗證明EDTA只影響金黃色葡萄球菌生物被膜形成的早期階段，加入EDTA時間越早對金黃色葡萄球菌的生物被膜的形成影響越大。從在加入EDTA和沒有加入EDTA的培養液中培養的金黃色葡萄球菌的生長曲線可以了解，EDTA對生物被膜的抑制可能與生長受到抑制有關。后面的聚集實驗，進一步證明了這一觀點。

因為EDTA作為一個螯合劑，可螯合金屬離子如鎂、鈣、鋇和鐵等。一開始假設的生物膜抑制是由于EDTA螯合。然而，實驗表明除去了Fe2+、Ca2+可阻斷EDTA對生物膜形成的抑制作用，證明EDTA對生物膜抑制作用，并非由于螯合性能。

聚集的形成說明細胞之間有粘附作用，加入EDTA后減少聚集的形成，說明EDTA能抑制細胞之間的粘附作用，可減少金黃色葡萄球菌的生物被膜形成，對食品生產及生活清潔中的抑制生物被膜的行程及易于消除有積極意義。

EDTA對金黃葡萄球菌生物被膜有抑制或分散的作用，因此，在食品工業中合理使用EDTA，可有效地防止金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。

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