五氯酚對稀有鮈鯽胚胎毒性效應研究

熊 力,馬永鵬,毛思予,蘇永良,金幫明,劉 堰* (.西南大學生命科學學院,淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室,水產科學重慶市市級重點實驗室,重慶 40075；.重慶市第三人民醫院檢驗科,重慶市臨床檢驗中心,重慶 40006)

五氯酚對稀有鮈鯽胚胎毒性效應研究

熊 力1,馬永鵬2,毛思予1,蘇永良1,金幫明1,劉 堰1*(1.西南大學生命科學學院,淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室,水產科學重慶市市級重點實驗室,重慶 400715；2.重慶市第三人民醫院檢驗科,重慶市臨床檢驗中心,重慶 400016)

研究五氯酚(PCP)對稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸和毒性效應.以7.5,30,60,120,250μg/L5個濃度的PCP對0hpf(hpf,受精卵孵出時間)的稀有鮈鯽胚胎進行暴露染毒,同時設置空白對照組、二甲基亞砜溶劑對照組和雌二醇(EE2,2.5ng/L)陽性對照組.在立體顯微鏡下觀察整個胚胎的發育過程,統計胚胎的孵化率、96hpf相對存活率和各時期的畸形率,并利用半定量RT-PCR檢測胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表達.結果表明,PCP暴露能延遲稀有鮈鯽胚胎發育,并造成胚胎卵凝結、心包囊腫、脊柱彎曲等多種畸形甚至死亡.隨著PCP暴露濃度的升高,稀有鮈鯽胚胎的孵化率和96hpf相對存活率降低,各時期的畸形率增加,并呈現一定的濃度效應.稀有鮈鯽胚胎CYP1A基因和p53基因mRNA表達被顯著誘導,并隨PCP濃度的升高而增加.PCP對稀有鮈鯽胚胎發育表現為顯著的毒性效應.稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對存活率、各時期畸形率及CYP1A基因和p53基因的誘導表達可以作為評價PCP毒性作用的敏感指標.

稀有鮈鯽；胚胎發育；五氯酚；毒性效應；CYP1A；p53

五氯酚(PCP)及其鈉鹽作為一種高效廉價的殺蟲劑、木材防腐劑及除草劑,在世界范圍內廣泛使用. PCP是氯酚類中最具毒性和最難降解的有機污染物,被美國EPA列為優先檢測污染物和潛在致癌物,也是我國優先監測污染物之一[1-2].其曾在中國長江中下游11個省、市、自治區被大范圍、長時間地用于殺滅釘螺和控制血吸蟲病,最終進入水體生態系統對水環境造成了持久污染[3-5].PCP性質較穩定,不易被氧化,易積累,具有很強的致癌、致畸、致突變性[6-7].對于多種魚類,PCP都具有強毒性,其 96hLC50值在 32～205μg/L之間[8].PCP可導致稀有鮈鯽血細胞和肝細胞DNA明顯的斷裂和遷移,造成DNA損傷[9],具有顯著的遺傳毒性.

利用魚類胚胎發育技術測定化學品的毒性作用具有材料方便易得、操作簡單、可重復性及可靠性較高等優點,而且與傳統的魚類急性實驗相比,成本低、影響因素少、靈敏度更高,現已被廣泛應用于化合物的致毒和致畸效應研究[10].稀有鮈鯽作為中國特有的一種實驗用魚,具有個體小,對溫度、溶解氧等環境條件適應性強,飼養方便,不易染病等優點,而且繁殖季節長,飼養條件下可以周年產卵,性成熟快,在水溫適宜和餌料充足條件下4個月左右即可達到性成熟并產卵[11].已有試驗證實,稀有鮈鯽對重金屬、農藥等化學品非常敏感,是進行化學品毒性測試和環境水樣毒性實驗的理想材料[12].但目前利用稀有鮈鯽胚胎發育技術研究內分泌干擾物毒性效應的工作還未見報道.因此,本研究以稀有鮈鯽的胚胎作為實驗材料,觀察 PCP暴露引起的胚胎發育變化,統計胚胎的孵化率、96hpf相對存活率、各時期的畸形率來評價PCP的發育毒性和致畸性,并選擇 CYP1A基因和抑癌基因 p53為生物標志物,為從分子水平上進一步探討五氯酚的胚胎毒性作用機制提供基礎.

1 材料和方法

1.1 實驗生物

健康的稀有鮈鯽種魚購于中國科學院武漢水生生物研究所,在本實驗室飼養繁殖超過4年,每天早晚喂養鹽水孵化的豐年蟲(豐年蟲卵購于天津丹陽水產有限公司).實驗用魚為性成熟的健康成魚體重:(0.53 ± 0.15)g, 體長:(36.6± 3.7)mm.按照雌雄比 1:2養在水族箱中,水溫: (26±1)℃、光照/黑暗周期=12h/12h,飼養2周后開始收集魚卵.飼養用水為連續曝氣24h的自來水,pH:7.6±1.5,溶解氧在 5mg/L以上,總硬度為7.8±0.7德國度.

1.2 實驗試劑及儀器

試劑:五氯酚(PCP,純度:99%)購于 Chem. Service,雌二醇(EE2,純度:98%)購于美國SIGMA,以二甲基亞砜(DMSO:購于Sanland- Chem)為溶劑,配制成各需要的濃度(實際染毒溶液中DMSO的濃度不超過 0.01%,經DMSO染毒稀有鮈鯽胚胎預實驗發現,DMSO濃度不超過0.01%時,稀有鮈鯽胚胎發育基本不受影響),Total RNA提取試劑(RNAiso Plus)、反轉錄試劑盒(Prime ScriptTMRT reagent kit)購于TaKara公司,其他試劑均為國產分析純.

所用主要儀器:玻璃水族箱,缸外過濾器, Nikon elicspe 80i生物顯微鏡,Nikon雙目立體顯微鏡,NUNC24孔細胞培養板,光照恒溫培養箱,凝膠成像儀(美國Bio-Rad),Mini-PROTEAN電泳系統(美國Bio-Rad),大龍可調式連續加樣移液器.

1.3 暴露實驗

按照文獻[10,13]方法設置稀有鮈鯽胚胎染毒實驗,開始實驗前配制7.5,30,60,120,250μg/L 5個濃度的PCP儲備溶液(濃度選擇依據本實驗室2次預試驗結果)和2.5ng/L一個濃度的EE2溶液作為陽性對照組,同時設置一個DMSO溶劑對照組和一個空白對照組.胚胎暴露染毒過程中的試驗用水,均為超濾除菌并充分氧飽和、溫度保持(26±1)℃ 的本地自來水.

由于化合物作用時間不同,作用靶位點各不相同,所以選擇同一批受精卵產出后立即進行染毒實驗,即 0hpf染毒.用立體顯微鏡挑選發育正常的稀有鮈鯽受精卵進行實驗.選用 24孔細胞培養板作為染毒器具,每孔容積為 3mL,實驗時每孔加入2mL試液,放入2枚受精卵,每塊多孔板中,10孔為同一實驗濃度,其余4個孔為空白對照,每個濃度在不同的板上做一個平行組.塑膠膜封面以免溶劑揮發改變實驗濃度.將密封好的多孔板放在(26±1)℃的光照培養箱中培養.每12h換液一次.為保證實驗統計的準確性,先后進行3次重復實驗.

1.4 顯微觀察

參照文獻[14]中斑馬魚可以觀察的毒理學終點、不同類型指標,文獻[15]中稀有鮈鯽胚胎不同時間的發育狀態,在不同時間段(暴露染毒后12,24,36,48,60,72,84,96h)觀察并記錄胚胎發育過程中一些具有代表性的毒理學終點并進行拍照.并統計各實驗組中稀有鮈鯽胚胎的孵化率、96hpf相對成活率、各時期畸形率(包括卵凝結、心包囊水腫、脊柱彎曲、尾部彎曲、發育異常等).

1.5 CYP1A和p53 mRNA定量分析

在稀有鮈鯽胚胎發育到 96hpf時,取出各實驗組中存活的胚胎進行CYP1A和p53 mRNA定量分析,每實驗組中3個胚胎合并為1個樣品.使用RNAiso Plus試劑提取各組樣品中總RNA,用紫外分光廣度計測定其濃度和純度,并用反轉錄試劑盒將等量的總 RNA反轉得到 cDNA.取1μLcDNA為模板,進行PCR反應檢測各實驗組胚胎中CYP1A和p53的表達情況.PCR反應體系為50μL,其中Buffer為5μL,25mmol/L Mg2+4μL, 2.5mmol/L dNTP 2μL,10mmol/L上下游引物各2μL,Taq酶0.5U.以β-actin為內參,CYP1A引物為5' AAAGCAATGGCTCTAACGG 3'和5' CGCAGGATAGGGATGAAAT 3',擴增片段為 743bp, p53基因為 5' CCACCATGAGAGAACACCTGAT 3'和5'GCTGAGGAGCTTCATAGAGAACC 3', 擴增片段為144bp,β-actin引物為5' CTACAGCTTCACCACCACA 3'和5' ATACCGCAAGATTCCATAC 3',擴增片段為 231bp.PCR程序為94℃預變性 10min;94℃變性 40s,56℃退火 30s, 72℃延伸40s,35個循環;最后72 ℃ 10min.PCR產物在 4℃冰箱保存,1%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統觀察并拍照.用Quantity One軟件分析圖像.CYP1A和p53的mRNA定量結果以相同起始量的β-actin進行校正,并以它們和β-actin電泳帶相對吸光度比值來表示.

1.6 數據統計

計算實驗各組稀有鮈鯽胚胎的孵化率、96hpf相對成活率、各時期畸形率[16].所有數據均用平均值±標準偏差表示.利用 SPSS 13.0軟件one-way ANOVA單因素方差分析比較處理組與對照組之間的差異顯著性,P＜0.05表示差異顯著.同時對差異顯著的稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對存活率及各時期畸形率與PCP濃度之間進行相關性分析.

2 結果

2.1 形態學觀察

稀有鮈鯽受精卵呈半透明狀,易于觀察,在生物立體顯微鏡下可以清楚地觀察到胚胎各不同時期的發育情況.本實驗共觀察了胚胎發育的 8個不同時期,空白正常組和PCP染毒組稀有鮈鯽胚胎各時期發育特征有明顯區別(表1).

表1 正常組和PCP染毒組稀有鮈鯽胚胎各時期發育特征Table 1 Developmental characteristics of normal and PCP exposed G. rarus embryos

圖1 不同濃度PCP處理后稀有鮈鯽胚胎發生畸變Fig.1 Deformation of G. rarus embryos after PCP treatment at different concentrations

各濃度 PCP處理后,稀有鮈鯽胚胎發育受到不同程度的影響,導致其胚胎和孵出幼魚產生各種畸形效應,結果見圖 1.從受精卵開始到PCP暴露12h,空白對照組和溶劑對照組稀有鮈鯽胚胎均未見異常癥狀,低濃度染毒組(＜30μg/L)發育也較正常,但高濃度染毒組(≥30μg/L)中則出現明顯的中毒癥狀,其中部分胚胎出現明顯卵黃渾濁或卵黃細胞被瓦解現象(圖 1A).正常稀有鮈鯽胚胎在囊胚期細胞高度分裂,但在強PCP毒性作用下,染毒組胚胎在進入外包期前就停止發育,導致胚盤細胞損毀而發生卵凝結.隨著 PCP染毒時間的增長,部分胚胎發育出現不規律的外包減少(圖1B)或胚胎發育一段時間后卵黃開始畸變(圖 1C).染毒 36h后,染毒組稀有鮈鯽胚胎出現胚中心包囊水腫現象(圖 1D),說明 PCP進入胚胎后影響了胚胎中血液循環.染毒60h后,高濃度組未死亡的胚胎發育較正常組緩慢,而低濃度組胚胎已可見孵化雛形,部分胚胎在顯微鏡下發現黑色素沉積較少(圖 2E).72h后,染毒稀有鮈鯽胚胎開始孵出,剛孵出的稚魚較正常組短,大部分為畸形,表現為脊柱彎曲(圖1F)、心包水腫(圖1G)、軀體彎曲(圖1H)、尾部彎曲(圖1I).96h時,染毒組孵化的稀有鮈鯽幼魚行動能力較弱,畸形加重出現死亡.隨著 PCP暴露的濃度的增加,稀有鮈鯽胚胎發育的延遲作用越明顯,且胚胎畸變的概率也增大.

2.2 稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對存活率和各時期畸形率

由圖2可見,在PCP暴露處理后,稀有鮈鯽胚胎的孵化率受到影響,并隨著 PCP濃度的升高而降低.空白對照組和溶劑對照組胚胎的孵化率都在 90%以上,PCP暴露各組稀有鮈鯽胚胎孵化率均有下降.當 PCP暴露濃度≥30μg/L時,稀有鮈鯽胚胎的孵化率下降顯著(P＜0.05),并呈現一定的濃度-效應關系(表 2),其相關系數R2為0.974. PCP暴露濃度為250μg/L組時,胚胎孵化率下降最為顯著(P＜0.01)僅為 10%,說明胚胎在此高濃度 PCP暴露后,90%以上死亡.隨著 PCP暴露濃度的升高,稀有鮈鯽胚胎96hpf的相對成活率也逐漸降低.當PCP暴露濃度≥30μg/L時,胚胎的96hpf相對成活率均下降顯著(P＜0.05),呈現良好的濃度-效應關系,R2＞0.98. 250μg/LPCP暴露組稀有鮈鯽胚胎的96hpf相對成活率接近于0(P＜0.01),說明96hpf以后此濃度下幾乎所有稀有鮈鯽胚胎均死亡.經過PCP暴露96h后,稀有鮈鯽胚胎的畸形率隨PCP濃度的增加而增加.當暴露濃度≥60μg/L時,胚胎的畸形率增加顯著(P＜0.05),與 PCP濃度呈現一定的效應關系,R2為0.9567. PCP濃度達到 250μg/L時,稀有鮈鯽胚胎的畸形率接近100%(P＜0.01). EE2陽性暴露組胚胎的孵化率、96h相對存活率和各時期畸形率與對照組相比也有顯著差異,說明 EE2也會影響稀有鮈鯽胚胎的發育.

圖2 不同濃度PCP和EE2暴露對稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對成活率及畸形率的影響Fig.2 Hatching rate, 96hpf relative survival rate and deformation rate of G. rarus embryos exposed to various concentrations of PCP and EE2

2.3 CYP1A和p53 mRNA定量分析

在稀有鮈鯽胚胎發育到 96hpf時,通過RT-PCR檢測發現,與空白對照組比較,PCP暴露各組胚胎中 CYP1A基因和抑癌基因 p53的mRNA表達量均隨 PCP濃度的升高而增加(圖3).CYP1A的半定量分析統計表明,空白、DMSO對照組及PCP、EE2各組胚胎中CYP1A表達量與β-actin基因的平均比值分別為:0.35、0.39、0.48、1.23、1.43、2.12、0.60(圖4).DMSO溶劑對照組與空白對照組相比不明顯, CYP1A基因mRNA表達量均較低.而PCP暴露各組中,CYP1A基因 mRNA表達均顯著增加并均有統計學意義.EE2暴露組中胚胎 CYP1A表達也增加顯著(P＜0.05).同時PCP暴露組中p53基因的表達量也隨PCP暴露濃度的升高逐漸增加(圖4).空白、DMSO對照組及PCP、EE2各組胚胎中p53表達量與 β-actin基因的平均比值分別為:1.50、 1.68、1.76、1.82、1.85、1.91、1.69.當PCP≥30μg/L時, p53基因mRNA表達量增加顯著具有統計學意義,P＜0.05.EE2同樣可以誘導胚胎中p53基因mRNA的表達,但效應不明顯.

表2 稀有鮈鯽胚胎孵化率、96hpf相對存活率和畸形率與PCP的劑量效應方程Table 2 Dose-response equation between hatching rate, relative survival rate, deformation rate and PCP concentration in G. rarus

圖3 CYP1A和p53基因mRNA表達的RT-PCR檢測結果Fig.3 CYP1A and p53 expression after PCP exposure by RT-PCR

圖4 不同濃度PCP和EE2暴露組稀有鮈鯽胚胎CYP1A和p53mRNA表達定量結果(n=6)Fig.4 CYP1A and p53 mRNA levels of G. rarus embryos exposed to various concentrations of PCP and EE2 by semi-quantitative RT-PCR

3 討論

PCP作為一種典型的水體污染物,可影響生物體的發育.蔣琳等[18]已發現PCP單獨暴露對斑馬魚胚胎發育具有較強的毒性效應,可導致胚胎產生各種畸形.本實驗中通過形態學觀察發現,PCP對稀有鮈鯽胚胎同樣有顯著的毒性效應.在12～24 hpf期稀有鮈鯽胚胎發育即進入分裂期,但PCP暴露染毒中的部分胚胎會出現嚴重的發育阻滯和卵黃凝結,從而影響稀有鮈鯽早期器官的形成,這些可作為稀有鮈鯽胚胎分裂期的致畸毒性終點指標.在 24～48hpf時,稀有鮈鯽胚胎發育進入成形期,血液循環系統逐漸成熟.此時部分PCP染毒胚胎可觀察到心包囊腫、心率不穩等現象,它們同樣可以作為評價毒性作用的生理指標.在染毒 72～84hpf時,低濃度染毒組開始孵化,但相對于空白和溶劑對照組已經延遲,而高濃度組仍然發育緩慢,說明稀有鮈鯽胚胎孵化時間的長短可以反映毒性作用的強弱.在染毒96hpf時,染毒組成活的稀有鮈鯽胚胎已全部孵化,可以觀察統計其孵化率、96hpf相對成活率和各時期畸形率.而稀有鮈鯽胚胎在PCP和EE2暴露染毒發育過程中,這3個指標均與對照組有顯著差異,并與PCP濃度呈現明顯的效應關系.

有研究[18-19]顯示,PCP暴露后斑馬魚胚胎發育過程中發展的fzd2、axin2等Wnt信號通路重要的調控基因表達均會發生顯著變化.而且應用基因芯片技術發現,暴露于五氯酚的斑馬魚胚胎中有14個涉及細胞凋亡的基因表達發生了顯著改變,說明PCP可能對胚胎發育具有基因毒性而導致其畸變甚至死亡.CYP1A是細胞色素 P450超家族的重要成員,參與多種環境致癌物、致突變物的代謝[20].CYP1A在正常魚體內組織的濃度很低,但在外來持久性有機污染物的誘導下,它的活性會升高.這主要是由于CYP1A基因的表達被污染物誘導劑高度誘導,使其表達水平顯著增加[21].因此,魚類 CYP1A基因作為一種有效的生物標志物已被廣泛的應用于對環境污染物的評價[22-23].魚類胚胎發育時期對環境內分泌干擾物十分敏感,它們不僅能導致胚胎發育產生各種畸形,還能誘導胚胎組織中 CYP1A的表達,可見內分泌干擾物對CYP1A的誘導與其毒性作用密切相關[24].而p53基因是迄今為止發現的與腫瘤相關性最高的腫瘤抑制基因, 50%以上的腫瘤發生都與p53基因的突變或功能的失調有關[25].在正常生理狀況下,p53表達水平很低,當受到外界環境刺激后,p53表達水平會升高[26],因此p53基因可作為環境污染物潛在致癌性的生物標志物.本研究中以稀有鮈鯽胚胎為研究對象,利用RT-PCR技術發現 PCP和 EE2可以誘導其中CYP1A基因和p53基因mRNA的表達,并隨PCP濃度的增加而升高具有顯著效應,進一步驗證了PCP對胚胎發育的基因毒性作用,對于揭示其致癌性和致畸性機理有一定幫助.

4 結論

4.1 PCP和EE2能夠影響稀有鮈鯽胚胎的發育,造成胚胎畸形發育遲緩、孵化率和96hpf相對成活率下降、畸形率增加.

4.2 PCP暴露染毒可以誘導稀有鮈鯽胚胎中CYP1A基因和p53基因mRNA的表達,并隨PCP濃度的升高而增加具有顯著的效應.

4.3 利用稀有鮈鯽胚胎發育評價PCP和EE2的致毒和致畸效應是可行的,對發現 PCP 的毒性作用機制、毒性敏感性及其在水體污染中的監測具有現實意義.

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Toxic effects of pentachlorophenol on the Chinese rare minnow embryos.

XIONG Li1, MA Yong-peng2, MAO Si-yu1, SU Yong-liang1, JIN Bang-ming1, LIU Yan1*(1.Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, Key Laboratory of Aquatic Science of Chongqing, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2.Clinical Laboratory Center of Chongqing, Laboratory of the Third People’s Hospital of Chongqing, Chongqing 400016, China). China Environmental Science, 2012,32(2)：337～344

The carcinogenicity and toxicity of pentachlorophenol (PCP) exposure on the Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) embryos were investigated. G. rarus embryos at 0 hour past fertilization (hpf) were exposed to PCP at different concentrations (0, 7.5, 30, 60, 120, 250μg/L). DMSO(＜0.01%,V/V) and 17α-ethynylestradiol (EE2, 2.5ng/L) were set as solvent control and positive control, respectively. The embryonic development was observed under the stereomicroscope. The hatching rate, relative survival rate at 96 hpf, and deformity rate through the entire embryos developmental process were calculated. Furthermore, the mRNA expressions of CYP1A and p53 gene were analyzed by semi-quantitatively RT-PCR. PCP exposure resulted in delayed embryonic development, condensation of embryonic eggs, formation of pericardial cysts, curvature of the spine or even death. The hatching rate and relative survival rate at 96 hpf were reduced while deformity rate were increased in a dose dependent manner of PCP. The mRNA level of CYP1A and p53 in embryos also were significantly up-regulated with increasing PCP concentration. PCP had significant toxic effects on G. rarus embryos. The hatching rate, relative survival rate at 96 hpf, malformation rate, CYP1A and p53 expression levels can be used as sensitive biomarkers to evaluate the toxic effects of PCP exposure on fish embryos.

Gobiocypris rarus；embryonic development；pentachlorophenol；toxic effects；CYP1A；p53

2011-05-02

國家自然科學基金資助項目(21147002);國家“973”項目(2012CB723205);三峽庫區生態環境教育部重點實驗室科學研究基金;重慶市自然科學基金資助項目(CSTC.2009BB1131)

* 責任作者, 教授, liuyan@swu.edu.cn

X503.225

A

1000-6923(2012)02-0337-08

熊 力(1985-),男,湖北隨州人,西南大學生命科學學院碩士研究生,研究方向為生物化學與分子生物學.發表論文2篇.