尖萼耬斗菜的傳粉機制與遺傳結構

龐 迪，史鳳雪，李志瑞，崔 娜，孫明洲，李霖鋒，肖洪興

（1.東北師范大學分子表觀遺傳學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024；

2.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024）

尖萼耬斗菜的傳粉機制與遺傳結構

龐 迪1，2，史鳳雪1，2，李志瑞1，2，崔 娜2，孫明洲2，李霖鋒1，2，肖洪興1，2

（1.東北師范大學分子表觀遺傳學教育部重點實驗室，吉林 長春 130024；

2.東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024）

對尖萼耬斗菜（AquilegiaoxysepalaTrautv.et C.A.Mey.）及其變型黃花尖萼耬斗菜（A.oxysepalaf.pallidiflora（Nakai）Kitag）進行了傳粉生物學與遺傳結構研究.結果表明，雖然尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的繁殖系統沒有差異，但其傳粉高峰期已經產生分化.其次，SSR數據顯示這二者的遺傳結構也產生了分化，為將來進一步研究其種內的微分化奠定了基礎.

毛茛科；尖萼耬斗菜；繁殖系統；傳粉；遺傳結構

尖萼耬斗菜（AquilegiaoxysepalaTrautv.et C.A.Mey.）隸屬于毛茛科（Ranunculaceae）耬斗菜屬（Aquilegia），多年生草本；該屬共有約70個物種，廣泛分布于歐洲、北美與亞洲等地區［1－3］.已有的研究顯示，耬斗菜屬大約于600萬年前起源于亞洲北部，然后于300萬年前分別擴散至北美與歐洲等地區，并隨后產生了適應性輻射.其中導致歐洲耬斗菜屬物種輻射成種的主要原因是生態位（niche）的變遷，而導致北美地區耬斗菜屬物種輻射成種的主要原因是傳粉者（pollinator）的改變［4］.由此可知耬斗菜屬是研究物種形成與適應性進化的優良材料.

根據《中國植物志》，我國東北地區約有7個耬斗菜屬物種，其中尖萼耬斗菜為該屬在東北地區最為常見的物種之一，其種內包括尖萼耬斗菜（A.oxysepala）及其變型黃花尖萼耬斗菜（A.oxysepalaf.pallidiflora（Nakai）Kitag）.二者在形態學上的主要區別為尖萼耬斗菜花瓣尖端為黃色，距和萼片為紫色；而黃花尖萼耬斗菜的距和萼片均為黃色［5］.Bradshaw和Schemske等（2003）曾對Mimulus cardinalis和M.lewisii進行了研究，發現花顏色的改變對傳粉者種類的變化起著較大的作用［6］.隨后，Hodges和Nathan等（2009）通過對北美地區的耬斗菜屬物種進行的相關研究也發現了耬斗菜屬各物種花顏色的改變對其傳粉系統以及物種分化起著關鍵的作用［7］.

鑒于花色的改變在物種進化過程中所扮演的重要作用，本文分別對尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉機制進行了研究.此外，運用簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）技術對尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜進行了遺傳結構分析，以期揭示花顏色的改變對二者傳粉系統與遺傳結構的影響.

1 材料與方法

1.1 傳粉生物學研究

1.1.1 樣地的選擇與套袋實驗 選取撫松縣露水河鎮的永清林場與21林班為研究地點，分別對尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的花進行套袋處理，具體操作如下：在同一植株中選擇部分花粉尚未成熟的花進行套袋，其余部分的花則讓其自然生長，檢測它們的繁殖系統（mating system）.

1.1.2 傳粉過程觀察 自8：00～17：00分別對尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜進行傳粉生物學觀察，并以30min為單位對傳粉者的種類、傳粉的次數以及方式進行統計.同時，捕獲部分傳粉者作為實驗的憑證.

1.2 分子生物學實驗

1.2.1 樣品的收集與DNA的提取 廣泛收集分布于長白山地區的尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜，并運用基因組DNA提取試劑盒（康為世紀出品）對所收集的樣品進行DNA提取，具體信息見表1.

居群編號 花色 個體數 采集地點 采集人BYG 黃色 5遼寧省冰峪溝 肖洪興紫色 5 DH 紫色 5 吉林省敦化市 肖洪興黃色 3 WCH 黃色 4 黑龍江省五常市 肖洪興LBSH 黃色 3 吉林省老白山 肖洪興LKZ 紫色 5黑龍江省林口縣 肖洪興

1.2.2 PCR檢測與毛細管熒光電泳 實驗所用的SSR引物參見文獻［8］，具體名稱分別是A6，A7，AA12，AA4，EST7.PCR反應體系為：ddH2O 14.4μL，10×buffer（含 Mg2＋）2μL，正引物與反引物各0.6μL，Taq酶（5U）0.2μL，DNA 50ng.反應程序為：95℃，5min；94℃，30s；退火溫度，30s；72℃，30s；35個循環；72℃，8min.實驗所用PCR檢測儀和毛細管熒光電泳儀型號分別為ABI2720（ABI，USA）和 ABI3730（ABI，USA）.

2 結果與分析

2.1 傳粉實驗結果

2.1.1 套袋實驗結果 對套袋處理的尖萼耬斗菜及其變型進行后統計發現，相對于同株未套袋的對照而言，尖萼耬斗菜的自交不育率高達80.3%，而且自交可育的果實中種子的數量為非套袋果實的85.0%，說明尖萼耬斗菜的繁殖系統為自交親和型（self-compatible）.與此類似，黃花尖萼耬斗菜的植株經套袋處理后，自交不育率為50%，但種子數量與對照組沒有明顯區別，因此，其繁殖系統也為自交親和型.由此可見，花色的改變對尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的繁殖系統沒有明顯的影響.2.1.2 傳粉生物學實驗結果 通過對尖萼耬斗菜及其變型的傳粉生物學實驗發現，雖然它們的傳粉者種類并沒有明顯的區別，但各種傳粉者的傳粉頻率有明顯差異，如二者的蜜蜂和黑胡蜂的傳粉比例存在差異（見圖1）.此外，對各個時間段傳粉頻率的研究發現，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉高峰期已經產生分化，尖萼耬斗菜的傳粉高峰期分別為上午8：30—9：00和10：00—10：30，而黃花尖萼耬斗菜的傳粉高峰期分別8：00—8：30和9：00—9：30（見圖2）.

圖1 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉者種類及其比例

圖2 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉者訪問頻率

2.2 PCR檢測與毛細管熒光電泳實驗結果

根據本實驗所獲得的5個SSR位點數據，分別對各個位點的等位基因數進行了統計（見表2）.根據該結果，在A6和EST7兩個位點上，黃花尖萼耬斗菜分別擁有獨特的等位基因，這說明其與尖萼耬斗菜的遺傳結構已出現遺傳分化的趨勢.此外，運用生物軟件POPULATION對尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜進行了系統樹的構建（見圖3），結果顯示，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的聚類關系已產生分化.例如，除DH1外，其余的尖萼耬斗菜個體都集中分布于A分支與B1分支中；而對于黃花尖萼耬斗菜而言，其個體并沒有依據采集地點發生聚類，這與表2的結果基本一致.由此可知，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的遺傳結構已經有分化的趨勢.

表2 尖萼耬斗菜與黃花尖萼耬斗菜各SSR位點的等位基因數 個

3 討論

3.1 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的傳粉生物學研究

本實驗的套袋結果顯示，花色的變化并沒有直接導致尖萼耬斗菜及其變型繁殖系統的改變，但套袋組的結實率低于對照組.在對花的結構進行解剖時也發現，最內層的雄蕊出現了功能退化的現象.根據此實驗結果，初步推斷尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜繁殖系統的結構特征是適應昆蟲傳粉的結果.

在對尖萼耬斗菜及其變型的傳粉者進行觀察時發現，二者的傳粉者種類并沒有明顯的差異，但是每種傳粉者的訪花頻率存在差異，這與以往的研究結果類似［9］.此外，對尖萼耬斗菜及其變型傳粉高峰期的分析發現，二者的高峰期已經錯開.有研究顯示，傳粉者訪問高峰往往與植物體產生花粉與花蜜的高峰期是協同的［10］.基于此，我們推測尖萼耬斗菜及其變型產生花粉和花蜜的時間已經分化，而導致該現象的原因可能是控制花粉和花蜜產生的相關基因已經開始分化.傳粉高峰期的分化會直接或者間接地導致尖萼耬斗菜及其變型之間基因流的減少，將增加二者之間的遺傳分化.

3.2 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的遺傳結構分析

圖3 尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的UPGMA樹

以往的研究顯示，傳粉系統的改變往往會導致遺傳結構的變化［11－13］，因此，采用SSR標記技術分別對分布于長白山地區的尖萼耬斗菜及其變型進行了遺傳結構的研究.結果顯示，尖萼耬斗菜及其變型的等位基因已初步產生分化.例如，在A6和EST7位點中黃花尖萼耬斗菜除了有與尖萼耬斗菜共同的等位基因外，還出現了一些特有的等位基因.產生這種現象的原因可能是由于這二者的傳粉系統產生了差異導致基因流的減少，并最終導致黃花尖萼耬斗菜擁有獨特的等位基因.此外，基于SSR數據構建的分子系統樹可知，雖然尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜并沒有完全分成兩個分支，但是這二者間也產生了初步的分化.綜上所述，尖萼耬斗菜及其變型黃花尖萼耬斗菜的遺傳結構已開始分化.

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The pollination system and genetic structure ofAquilegiaoxysepalaTrautv.et C.A.Mey.

PANG Di1，2，SHI Feng-xue1，2，LI Zhi-rui1，2，CUI Na2，SUN Ming-zhou2，LI Lin-feng1，2，XIAO Hong-xing1，2

（1.Key Laboratory of Molecular Epigenetics of MOE，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；
2.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

The speciesAquilegiaoxysepalaTrautv.et.C.A.Mey，which belongs to the genusAquilegiaof family Ranunculaceae，is a perennial herb and widely distributes in northeast of China.This paper analyses the pollination system and genetic structure of the speciesAquilegiaoxysepalaand its formaA.oxysepalaf.pallidiflora（Nakai）Kitag.According to the results，despite there are no obvious differences in the mating system，they exhibit differentiation in pollination peak and genetic structure.These findings provide us fundamental information for future studies of microevolution.

Ranunculaceae；Aquilegiaoxysepala；mating system；pollination；genetic structure

Q 941＋.3

180·5155

A

1000-1832（2012）01-0132-04

2010-08-22

中央高校基本科研業務費專項資金資助項目（10QNJJ011）.

龐迪 （1987—），女，碩士研究生；通訊作者：肖洪興（1963—），男，博士，教授，主要從事植物系統與進化研究.

方 林）