HPLC－MS/MS測定豬肉和豬肝中氯霉素殘留量的研究

劉吉成

（廣西玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000）

HPLC－MS/MS測定豬肉和豬肝中氯霉素殘留量的研究

劉吉成

（廣西玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000）

建立高效液相色譜－串聯質譜法（HPLC－MS/MS）檢測豬肉和豬肝中氯霉素藥物殘留的分析方法。樣品經4%的氯化鈉溶液和乙腈提取并沉淀蛋白質，正己烷脫脂凈化，乙酸乙酯液液萃取，再濃縮定容，上HPLC－MS/MS儀器，用Syncronis C18柱分離，以乙腈－水（40∶60）作為流動相，采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式，多反應監測（MRM）方式檢測，用氯霉素－D5作內標物來定量。在該試驗條件下，氯霉素在1～15ng/mL濃度呈良好的線性關系，r＝0.999 2，最低檢出濃度為0.1μg/kg，樣品的加樣回收率在90.0%～110.0%，重復性好RSD＜3.0%。該方法能對豬肉和豬肝中氯霉素殘留進行定性及定量分析，方法精密度較好、準確度較高、選擇性好，結果滿意。

高效液相色譜－串聯質譜；氯霉素；豬肉；豬肝；殘留

氯霉素是一種酰胺醇類抗生素，可用于各種革蘭氏陰性細菌疾病的治療，曾被大量應用于畜禽及水產養殖業中，但濫用會導致再生障礙性貧血、粒狀白細胞缺乏等不良反應［1］。許多國家都禁止在食用性動物飼養和治療中使用氯霉素，即最大殘留限量（MRL）為0mg/kg，中國農業部193號公告中將氯霉素作為一種禁用物質［2］。

目前國內外常用免疫法和化學分析檢測法測定氯霉素殘留。粗篩方法有酶聯免疫法（ELISA）、微生物法和生物傳感器法，確證方法有：液相色譜、氣相色譜、氣相色譜－質譜聯用和液相色譜－質譜聯用等方法［1］。液質聯用方法是首選的最佳檢測手段，具有檢出限低、重現性好以及假陽性少等優點。

有報道［3－5］用 HPLC、GC－MS和 HPLC－MS/MS測定豬肉中氯霉素的含量，結果發現HPLC測定氯霉素靈敏度相對低；用GC－MS測定氯霉素殘留，氯霉素必須衍生化后才能測定，操作復雜。本試驗采用HPLC－MS/MS測定豬肉和豬肝中氯霉素殘留，直接用對照品加到空白基質中做標準曲線，采用液液萃取進行提取和純化，內標法定量，實現了消除基質效應，定量準確的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

高效液相－質譜聯用儀（配 MassLy4.1數據處理軟件）：Waters2695－Quattro MicroTMAPI，美國 Waters公司；

氮氣發生器：LC/MS20－1，英國Domnick hunter公司；

高速冷凍離心機：K280R，英國Centurion（森特恩）公司；

旋轉蒸發器：Hei－VAPA 德國Heidolph公司；

氮吹儀：N－EVAPTM－112，美國 Organomation Associates公司；

電子分析天平：XS－205DU，美國 Mettler Toledo公司。

1.1.2 標準物質和試劑

乙腈、正己烷：色譜純，美國Fisher Scientific公司；

試驗用水：超純水，自制；

氯化鈉、乙酸乙酯等：分析純，廣東光華化學廠有限公司；

氯霉素對照品：含量99.5%，批號130555－200501，中國生物制品檢定所；

氯霉 素－D5：100ng/μL，德 國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 對照品和內標溶液的配制

1.2.1 對照品溶液的配制 取氯霉素對照品10.73mg，置100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，再精密量取1mL置100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻作為對照品儲備液。

1.2.2 內標溶液的配制 精密量取氯霉素－D5（100ng/μL）1mL置100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度即得內標工作液（濃度為1μg/mL）。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品制備 豬肉去皮后絞碎，豬肝直接絞碎，分別裝入包裝袋，－20℃保存。

1.3.2 樣品提取 取測試樣品約5g，置50mL離心管中，加1μg/mL氯霉素－D5內標工作液10μL，加乙腈5mL，4%氯化鈉 溶 液［6，7］5mL，渦旋振蕩 2min，6000r/min 離 心10min，取上清液至另一50mL離心管中，重復提取一次，合并提取液。提取液中加乙腈飽和的正己烷5mL，渦旋振蕩1min，6 000r/min離心5min，棄去上層液（油脂多時可以多凈化幾次），加水飽和乙酸乙酯溶液5mL，渦旋振蕩1min，6 000r/min離心5min，將上層液轉移到100mL平底燒瓶中，重復提取3次，合并提取液，在40℃水浴減壓濃縮至約0.5mL，用氮氣吹至近干，殘渣加乙腈－水（40∶60）1.00 mL超聲溶解，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續濾液，即得。

1.4 色譜條件和質譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：SyncronisC18，粒徑5μm，150×2.1mm；柱溫：35℃；進樣量20μL；流動相：乙腈－水（40∶60）；流速：0.25mL/min。

1.4.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），負離子模式，采集方式為多反應監測（MRM）；毛細管電壓為2.8kV；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣氮氣流速為750L/h；錐孔氮氣流速為100L/h［8，9］；碰撞氣為氬氣；定性離子對、定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量見表1。

表1 氯霉素和氯霉素－D5的質譜參數Table 1 The parameters of chloramphenicol and chloramphenicol－D5in MS

2 結果與分析

2.1 線性關系

取5份空白基質，將對照品儲備液加到空白基質中，再在每個濃度中加入氯霉素－D5儲備液（1μg/mL）10μL，按1.3.2進行處理得到濃度分別為 1.0，5.0，8.0，10.0，15.0ng/mL的標準系列，氯霉素－D5濃度為10ng/mL。按1.4的條件測定，按照內標法計算得到曲線方程：

式中：

Y——響應值（對照品峰面積×內標物濃度/內標物峰面積），ng/mL；

X——對照品濃度，ng/mL。

內標物的RSD為3.3%。標準曲線圖見圖1，對照品中各個離子和總離子流圖色譜圖分別見圖2和圖3。

圖1 氯霉素標準曲線圖Figure 1 The standard curve of chloramphenicol

2.2 準確度和精密度試驗

分別取空白的樣品基質豬肉和豬肝約5g，添加不同濃度的氯霉素，用內標法做加樣回收試驗，測定的數據見表2和表3。

由表2和表3可知，樣品回收率都在90%～110%，相對偏差都少于3.0%，說明該方法對豬肉和豬肝等樣品含有氯霉素測定均有較好的準確度和精密度。

2.3 檢出限

根據限量要求，對豬肉和豬肝加標回收試驗，當添加濃度為0.1μg/kg時，定量離子信噪比S/N＝3.1，試驗結果表明氯霉素的檢出限為0.1μg/kg。

圖2 對照品溶液MRM色譜圖Figure 2 MRM chromatogram of standard solution

圖3 陽性豬肉樣品MRM色譜圖Figure 3 MRM chromatogram of positive Pork sample

2.4 樣品的測定

在市場上畜禽類共抽樣160批，其中豬肉128批，豬肝32批，其中豬肉檢出有氯霉素的有8批，豬肝0批，其濃度均在2～50μg/kg。

表2 豬肉樣品加樣回收的數據Table 2 Sample recovery results of pork

表3 豬肝樣品加樣回收的數據Table 3 Sample recovery results of pig liver

3 討論

（1）在選擇流動相時，曾嘗試用乙酸胺加0.1%甲酸做水相，發現對照品均不出峰，而以純水作水相時有峰出現。這可能是離子的存在干擾了化合物的電離。在選擇有機相的時候，采用甲醇和乙腈均可行，但使用乙腈其靈敏度稍高，所以以乙腈和水作為流動相。

（2）在樣品提取的過程中，僅用乙腈提取的時提取物的油脂含量較高，凈化較為困難，但加入4%NaCl溶液以后，可有效降低提取物的油脂含量。

（3）在配制標準曲線的過程中，加基質的對照品的峰面積和不加基質的相差比較大，說明基質效應強，所以選擇對照品加到空白基質中來配制標準曲線，可以消除基質效應帶來的偏差。

4 結論

本試驗建立的高效液相色譜－串聯質譜法檢測畜禽類中豬肉和豬肝氯霉素殘留，采用乙腈和4%NaCl溶液提取樣品中氯霉素成分，并同時沉淀樣品中的蛋白質，用正己烷除掉油脂性成分，再用乙酸乙酯萃取，濃縮，內標法定量，并用空白基質加對照品做標準曲線。本方法準確可靠，重現性好。與其他檢測方法相比，在前處理上易于操作，減少了基質效應，檢驗成本低，適用范圍廣，靈敏度高，重現性好，準確可靠，選擇性好，可用于畜禽類氯霉素殘留的檢驗方法。

1 任佳，鄭小平，黃菲菲，等.UPLC－MS/MS法測定乳制品中氯霉素類藥物［J］.食品與機械，2011，27（4）：75～78.

2 劉正才，楊方，余孔捷，等.獸藥粉中氯霉素類和硝基呋喃類藥物的液相色譜－串聯質譜分析方法的研究［J］.中國獸藥雜志，2011，45（9）：40～43.

3 李海平，張樹海，張坤生.GC－MS分析法在豬肉氯霉素殘留檢測中的應用［J］.食品與機械，2006，22（5）：89～92.

4 農以寧，蔡江帆，蒙肇云，等.SPE－HPLC法同時測定豬肉中常見的抗生素和克侖特羅的研究［J］.桂林電子科技大學學報，2009，29（5）：406～409.

5 楊總，李秀琴，王娟，等.同位素稀釋液相色譜－串聯質譜法準確測定豬肉中的氯霉素殘留［J］.色譜，2011，29（9）：927～931.

6 中國國家標準化管理委員會.GB/T22338——2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的殘留測定［S］.北京：中國標準出版社，2008.

7 李麗莉，羅軼.液相色譜－串聯質譜測定雞肉中氯霉素殘留［J］.中國衛生檢驗雜志，2011，21（6）：1 357～1 358.

8 張立堅，張俊杰，張良滔，等.液相色譜－質譜法檢測漁業養殖水中硝基呋喃及氯霉素藥物［J］.質譜學報，2011，32（4）：207～210.

9 陳君義，孫慧宇，舒永蘭，等.同位素內標液相色譜－串聯質譜法測定動物源性食品中氯霉素殘留［J］.化學分析計量，2011，20（2）：46～48.

Determination of chloramphenicol residues in pork and pig liver by LC－MS/MS

LIU Ji－cheng

（YuLin Institute for Food and Drug Control，Yulin，Guangxi537000，China）

A method of determination of chloramphenicol in pork and pork liver by High Liquid chromatography－Tandem Mass Spectrometry（HPLC－MS/MS）was developed.Samples were extracted with acetonitrile and 4%sodium chloride solution，and precipitation protein at the same time，defatted by hexane，and Ethyl acetate liquidliquid extraction，then concentrated and constanted volume.Samples were detected by LC－MS/MS and isolated with Syncronis C18and the liquid phase was acetonitrile and water（40∶60），The electrospray ionization（ESI）mass spectrometry was run in negative ion multiple reaction monitoring mode，taking the chloramphenicol－D5as internal standard.At these experimental conditions，chloramphenicol had a good liner relatively（r＝0.999 2）between 1～15ng/mL.recovery rate of samples ranged from 90.0%～110.0%，with LOD of 0.1μg/kg，and replicability was RSD＜3.0%.This method could detect the chloramphenicol residue in pork and pork liver，and with a better precision，higher accuracy，better specificity，and the result was satisfied.

HPLC－MS/MS；chloramphenicol；pork；pig liver；residues

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.025

劉吉成（1982－），男，廣西玉林食品藥品檢驗所主管藥師，碩士。E－mail：liujichenggood＠126.com

2012－01－22