TOLL樣受體抗體對鼠瘧疾病理進程的影響

摘要：利用ＴＯＬＬ樣受體抗體（ＴＬＲｓ）尾靜脈注射并封閉對應ＴＬＲ的方法，觀察瘧疾病理進程的變化。結果表明，ＴＬＲ２、９、１１抗體處理后小鼠的存活率在第１０天分別為７０％、０、０，對照組為５０％；ＴＬＲ２、９、１１抗體處理后小鼠的紅細胞感染率峰值分別為５５％、６１％、５８％，對照組為５２％。抗體封閉ＴＬＲ２后，可提高小鼠的存活率；抗體封閉ＴＬＲ９、１１后，小鼠紅細胞感染率顯著升高而存活率顯著降低。證明ＴＬＲ是一類有潛力的抗瘧藥物或治療輔助藥物的靶點。

關鍵詞：瘧疾；尾靜脈注射；ＴＯＬＬ樣受體；抗體

中圖分類號：Ｒ３９２．１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1364-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ａｎｔｉ－ＴＬＲｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ Ｍａｌａｒｉａ ｉｎ Ｒｉｃｅ

ＳＵＮ Ｆｅｉ１，ＸＵ Ｂｉｎｇ－ｈｏｎｇ１，ＹＡＮＧ Ｘｉａｏ－ｌｉｎ２ａ，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｕ－ｈｏｎｇ２ｂ，ＬＩＵ Ｓｈｉ－ｇｕｏ１

（１． Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ； 2ａ．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｉｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ；

2ｂ．Ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ Ｂｉｏ－Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ＴＬＲｓ） ｉｎ ｒｉｃｅ ｗｅｒｅ ｂｌｏｃｋｅｄ ｂｙ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｎｔｉ－ＴＬＲ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ＧＩＭＳＡ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＬＲ２， ９ ａｎｄ １１ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｍｉｃｅ ａｔ ｄａｙ １０ ｗｅｒｅ ７０％， ０ ａｎｄ ０， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｆ ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ ｗｅｒｅ ５５％， ６１％， ５８％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ５０％ ａｎｄ ５２％ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｔ was ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｂｙ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＴＬＲ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ａｆｔｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＬＲ９ ａｎｄ １１ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｔｈｅ ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ． Ｉｔ was ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＴＬＲｓ ｗｅｒｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｎｅｗ ａｎｔｉ－ｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｌａｒｉａ； ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ； TLRs； ａｎｔｉｂｏｄｙ

瘧疾是一種在熱帶和亞熱帶地區造成大量死亡的惡性傳染病，以雌性按蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）為傳播媒介［１］。近年來由于在非洲和東南亞地區抗藥性蟲株的快速擴散使得全球抗瘧的形勢十分嚴峻［２］。在瘧疾的死亡病例中，病人往往伴隨著嚴重的炎癥反應。深入了解瘧疾的病理過程將有助于尋找新的藥物靶點和開發新型的抗瘧藥物。Ｔｏｌｌ樣受體（ＴＬＲｓ）是機體天然免疫的核心分子，與多種感染性疾病和自身免疫性疾病有著密切的關系［３］。目前ＴＬＲｓ家族已發現的成員有１０多個。其中，已有研究報道ＴＬＲ１１在弓形蟲感染的過程中通過感知弓形蟲的肌動蛋白抑制蛋白樣蛋白而啟動下游免疫反應，大幅提高ＩＬ－１２等促炎癥因子的血清水平［４，５］。肌動蛋白抑制蛋白是一種在進化上非常保守的蛋白質［６，７］。弓形蟲和瘧原蟲的這一蛋白質非常相似［８］，之前的研究已經證明在瘧原蟲的侵染過程中ＴＬＲ１１的ｍＲＮＡ水平大幅升高。除ＴＬＲ１１之外，ＴＬＲ２和ＴＬＲ９的ｍＲＮＡ水平也有不同程度的升高。但關于這些ＴＬＲｓ對瘧疾病理進程的影響尚無報道。本研究通過抗體尾靜脈注射的方法選擇性地封閉小鼠不同的ＴＬＲｓ并以伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei Anka）感染小鼠，觀察小鼠被抗體封閉后的病理變化，以期深入探討ＴＬＲｓ在瘧疾病理過程中的作用。

１ 材料與方法

１．１ 動物模型的構建

１．１．１ 試驗動物 ４～６周齡昆明小白鼠９０只，體重１８～２２ ｇ，購自新鄉醫學院動物中心；原生動物門伯氏瘧原蟲（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ Ａnka），購自北京大學醫學院寄生蟲學教研室；ＴＬＲ２、９、１１抗體購自ＳＡＮＴＡ ＣＵＲＺ公司。

１．１．２ 感染小鼠 初次感染時，取１０只小鼠，然后從液氮中取出凍存的伯氏瘧原蟲（其保存于冷凍的小鼠外周血中），３７ ℃解凍復蘇，每只小鼠腹腔注射含伯氏瘧原蟲的血液０．３ ｍＬ。待小鼠外周血被蟲體感染的紅細胞超過３０％后，摘除小鼠眼球取血，并加肝素抗凝。２ ５００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，棄上清，并加入滅菌生理鹽水，重新懸浮紅細胞，并重復上述步驟，重復洗３次后，加入滅菌生理鹽水并懸浮紅細胞，用于再次感染試驗用小鼠。

１．２ 分別封閉小鼠的ＴＬＲ２，９，１１

取４０只昆明小鼠，隨機分為４組。取其中３組分別經尾靜脈給每組小鼠注射ＴＬＲ２、９、１１抗體０．１ ｍＬ，每隔２４ ｈ注射１次，連續注射３次；其余１組設為對照組，并經尾靜脈給每只小鼠注射兔ＩｇＧ抗體 ０．１ ｍＬ，每隔２４ ｈ注射１次，連續注射３次。在注射第一次抗體后將４組小鼠經腹腔注射感染伯氏瘧原蟲，觀察各組小鼠紅細胞的感染率和小鼠的存活率。

１．３ 感染率的檢測

在小鼠感染伯氏瘧原蟲后每２４ ｈ取小鼠尾血１滴，滴在載玻片上推制薄血膜，室溫晾干后用甲醇固定，用５％ＧＩＭＳＡ染液染色３０ ｍｉｎ。在油鏡下觀察薄血膜，并計數２ ０００個紅細胞，計算感染率。

２ 結果與分析

２．１ 封閉ＴＬＲs對小鼠存活率的影響

試驗用ＴＬＲ２、９、１１的抗體分別處理小鼠，封閉對應的ＴＬＲ，并隨后給小鼠感染瘧疾，并給對照組小鼠注射兔ＩｇＧ抗體，以排除抗體的非特異性結合的影響。由圖１可知，ＴＬＲ９、１１抗體注射組小鼠分別于第10天和第9天全部死亡，對照組小鼠在第１０天有５０％存活，而ＴＬＲ２抗體注射組小鼠的存活率在第１０天達到７０％。與對照組相比，ＴＬＲ２抗體處理后小鼠的存活率明顯上升；而ＴＬＲ９、１１抗體處理后小鼠的存活率明顯下降（Ｐ＜０．０５）。

２．２ 封閉ＴＬＲs對小鼠的紅細胞感染率的影響

由圖２可知，ＴＬＲ２抗體處理的小鼠在第６天紅細胞感染率達到峰值，為５５％；而ＴＬＲ９和ＴＬＲ１１抗體處理的小鼠紅細胞感染率在初期會迅速上升，并分別在第６天和第４天達到峰值，分別為６１％和５８％。ＴＬＲ２抗體處理后小鼠的紅細胞感染率與對照組相比沒有明顯變化，而ＴＬＲ９、１１抗體處理后小鼠的紅細胞感染率明顯上升，與對照組相比第２、３、４、５天的紅細胞感染率存在顯著差異（Ｐ＜０．０５）。

３ 討論

近期有研究表明，在ＭｙＤ８８和ＴＲＩＦ缺陷的小鼠中，感染瘧疾后小鼠只有非常輕微的癥狀，通過這一結果可以判斷，在瘧疾的重癥病例中，炎癥反應給機體造成的傷害要遠大于瘧疾本身［９，１０］，通過抑制ＴＬＲ表達或抑制其二聚化作用而抑制炎癥反應可能是降低惡性瘧疾患者死亡率的一個途徑。

在ＴＬＲ２抗體封閉之后，對小鼠的紅細胞感染率沒有明顯的影響，但是顯著地降低了小鼠的死亡率。這一結果顯示，瘧疾造成的死亡病理至少部分是由于機體自身的炎癥反應造成的。有研究表明［１１］，當ＴＬＲ２被封閉之后，其下游的炎癥因子如ＩＬ－６等的水平均會受到影響。而當封閉ＴＬＲ９或ＴＬＲ１１時，小鼠的感染率和死亡率均迅速升高。通過這些試驗可以推測，ＴＬＲｓ對瘧疾感染初期的宿主防御非常重要，通過對ＴＬＲｓ的選擇性封閉，可以有效地影響小鼠模型的瘧疾病理進程。ＴＬＲｓ是一類有潛力的抗瘧藥物或治療輔助藥物的靶點。本研究中發現不同的ＴＬＲ對不同的病理現象發揮作用，如ＴＬＲ２在被封閉之后影響了小鼠的死亡率，而ＴＬＲ９和ＴＬＲ１１被封閉之后則可同時影響小鼠的死亡率和感染率。

參考文獻：

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［８］ ＫＵＣＥＲＡ Ｋ， ＫＯＢＬＡＮＳＫＹ Ａ Ａ， ＳＡＵＮＤＥＲＳ Ｌ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Tｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ｐｒｏｆｉｌｉｎ： A ｐａｒａｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｔｉｆ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ １１［Ｊ］． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２０１０，４０３（４）：６１６－６２９．

［９］ ＥＲＤＭＡＮ Ｌ Ｋ， ＦＩＮＮＥＹ Ｃ Ａ， ＬＩＬＥＳ Ｗ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍａｌａｒｉａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ＴＬＲｓ ｓｈａｒｅ ｔｈｅ ｓｔａｇｅ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ， ２００８，１６２（２）：１０５－１１１．

［１０］ ＹＡＭＡＭＯＴＯ Ｍ， ＳＡＴＯ Ｓ， ＨＥＭＭＩ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ａｄａｐｔｏｒ ＴＲＩＦ ｉｎ ｔｈｅ ＭｙＤ８８－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０１（５６３３）：６４０－６４３．

［１１］ ＪＡＮＧ Ｓ， ＵＥＭＤＴＳＵ Ｓ， ＡＫＩＲＡ Ｓ， ｅｔ ａｌ． ＩＬ－６ ａｎｄ ＩＬ－１０ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ＴＬＲ２－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ２００４，１７３（５）：３３９２－３３９７．