對氧磷酶1參與香豬高脂模型脂質代謝研究

徐霖 李升１，３，冉雪琴１，３，王嘉福１，３

（１．貴州大學動物科學學院，貴陽 ５５００２５；２．貴陽學院生物與環境工程系，貴陽 ５５０００５；

３．貴州大學教育部綠色農藥與農業生物工程重點實驗室，貴陽 ５５００２５）

摘要：豬動脈粥樣硬化形成過程和解剖特征與人極為相似，為研究動脈粥樣硬化發病機理，建立了貴州小香豬高脂模型，并設了對照組。通過飼養試驗，測定豬動脈粥樣硬化形成過程中與脂質代謝密切相關的４種關鍵因子，即血清總膽固醇（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＴＣ）、低密度脂蛋白（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＬＤＬ）、高密度脂蛋白（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＨＤＬ）、超氧化物歧化酶 （Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ， ＳＯＤ） 及對氧磷酶１ （Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１， ＰＯＮ１）活性，研究PON1與脂質代謝之間的關系。研究結果顯示，PON1在香豬高脂模型中活性降低。

關鍵詞：動脈粥樣硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ，AS）；對氧磷酶1（Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１）；脂質代謝；香豬；高脂模型

中圖分類號：Ｒ５７５ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1404-03

Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ-1 ｏｎ Ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ Ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉａｎｇ Pｉｇ

ＸＵ Ｌｉｎ１，２，ＬＩ Ｓｈｅｎｇ１，３，ＲＡＮ Ｘｕｅ－ｑｉｎ１，３，ＷＡＮＧ Ｊｉａ－ｆｕ１，３

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｇｕｉｙａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００５， Ｃｈｉｎａ； ３． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ａｎｄ ａｎａｔｏｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ Ｘｉａｎｇ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｂｅｉｎｇｓ， ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉａｎｇ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗｅｒｅ ｓｅｔ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒｓ closely ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｐｏｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｕｃｈ ａｓ ＴＣ（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ），ＬＤＬ（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）， ＨＤＬ（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）， ＳＯＤ（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ dｉｓｍｕｔａｓｅ） ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＮ１ （pａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１） ｉｎ ｔｈｅ ｐｉｇｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ＰＯＮ１ ａｎｄ ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＮ１ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ Ｘｉaｎｇ ｐｉｇｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ； ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ-1； ｌｉｐｏｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ； Ｘｉａｎｇ ｐｉｇ； ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉｃ ｍｏｄｅｌ

近年來，越來越多的基礎和臨床研究進一步證實動脈粥樣硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ，AS）是一種累及血管、代謝和免疫等多系統的炎癥性疾病，但其確切病因及發病機理目前尚未完全闡明。對氧磷酶１（Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１，ＰＯＮ１）因水解神經毒殺蟲劑對氧磷（Ｐａｒａｏｘｏｎ）而命名，血清ＰＯＮ１是肝臟分泌的一種能夠水解多種有機磷化合物的鈣離子依賴性酯酶， 具有重要的抗氧化作用。

在不同動物中有關對氧磷酶研究較多，但目前在大型牲畜中研究動脈粥樣硬化發病機制還存在不少空白。豬動脈粥樣硬化形成過程和解剖特征與人極為相似，本試驗通過建立貴州小香豬動脈粥樣硬化模型，測定與脂質代謝密切相關的4種關鍵因子：血清總膽固醇（Ｔｏｔａｌ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ， ＴＣ）、低密度脂蛋白（Ｌｉｇｈｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ， ＬＤＬ）、高密度脂蛋白（Hｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＨＤＬ）、超氧化物歧化酶 （Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，ＳＯＤ）及對氧磷酶１ （Ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ－１，ＰＯＮ１）的活性，研究對氧磷酶１與脂質代謝之間的關系，為研究動脈粥樣硬化發病機制提供大型牲畜的模型數據參考。

１ 材料與方法

１．１ 材料

試驗用小香豬購自貴州榕江（１０頭）。

采血方法：上腔靜脈竇采血，５ ｍＬ/頭，血清測酶活性及各項指標。

１．２ 方法

１．２．１ 動脈粥樣硬化模型建立 １０頭小香豬分為對照組和試驗組，每組５頭。對照組只喂給基礎飼料，試驗組于基礎飼料中拌入１５％蛋黃粉（或者豬油）、４％膽固醇。基礎飼料平均按２５ ｇ／（ｋｇ·ｄ）分２次給予。

１．２．２ 一般臨床觀察 每日觀察小香豬的一般臨床表現，每月稱１ 次體重。

１．２．３ ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ、ＳＯＤ測定 分別用ＴＣ測定試劑盒、ＬＤＬ測定試劑盒、ＨＤＬ測定試劑盒、ＳＯＤ測定試劑盒（以上試劑盒均為南京建成生物工程有限公司生產）進行測定。

１．２．４ Ｐ０Ｎｌ活性的測定 血清ＰＯＮ１活性的測定采用連續測定方法［１］，以對氧磷為底物，在８００ μＬ甘氨酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，２ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＯＮ， ｐＨ １０．５）中加入２０ μＬ的血清，血清中的ＰＯＮ１可以催化對氧磷水解產生有色物質對硝基酚，通過紫外分光光度計在４０５ ｎｍ波長處每隔１０ ｓ共３ ｍｉｎ連續測定吸光度值，算出平均吸光度變化值，根據公式 ＰＯＮ1（Ｕ／Ｌ）＝△Ａ／ｍｉｎ×ＴＶ×１０６／（ε×ＳＶ×Ｌ ）求出單位體積血清ＰＯＮ1活性。式中△Ａ／ｍｉｎ為每分鐘吸光度變化值，ＴＶ為反應總體積（ｍＬ），ＳＶ為樣本體積（ｍＬ），Ｌ為比色杯光徑（１ ｃｍ），１０６是將ｍｏｌ換算成μｍｏｌ的系數，ε為對硝基酚在４０５ ｎｍ波長處的摩爾消光系數１７ １４３（ｃｍ２／ｍｏｌ）。

１．２．５ 統計分析 測得數據用ＳＰＳＳ １３．０軟件處理后用（ｘ±ｓ）表示，采用ｔ檢驗法檢驗組間及組內差異。

２ 結果與分析

２．１ 體重測定結果

通過連續３２周的飼喂，對照組和高脂組體重均有增加（圖１）。對照組體重由（２１．１±３．１） ｋｇ增加到（３９．９±５．５） ｋｇ，增加８９．１％，而高脂組體重從（１７．０±１．９） ｋｇ增加到（４８．５±６．６） ｋｇ，增重１８５．３％，增重程度顯著高于對照組（Ｐ＜０．０５）。

２．２ 血脂水平變化情況

本試驗對對照組和高脂組的血清總膽固醇（ＴＣ）、高密度脂蛋白（ＨＤＬ）、低密度脂蛋白（ＬＤＬ）分別進行了監測（圖２），相對于對照組，高脂組的血清ＴＣ、ＬＤＬ和ＨＤＬ含量均在１６周之前增長迅速，與對照組相比差異顯著（Ｐ＜０．０５），在１６周時增幅均達到最大值，而對照組在整個試驗過程中各指標變化無顯著差異。高脂組的血清ＴＣ含量在１６周時為（４．０６±０．４５） ｍｍｏｌ／Ｌ，相對于對照組［（２．１５±０．３１）ｍｍｏｌ／Ｌ］增加了８８．８％，差異極顯著（Ｐ＜０．０１）；而高脂組的ＬＤＬ和ＨＤＬ含量在１６周時分別為（１．２３±０．１５） ｍｍｏｌ／Ｌ和（１．３６±０．１２） ｍｍｏｌ／Ｌ，分別為同時期對照組的１．２倍和１．１倍，統計學分析差異顯著（Ｐ＜０．０５）。在１６周后，高脂組中的ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ含量有所降低，但在３２周時，ＴＣ和ＨＤＬ含量仍明顯高于對照組（Ｐ＜０．０５），ＬＤＬ含量略高于對照組。根據以上３個指標的變化，說明高脂飼料飼喂香豬１６周后可以顯著增加其血脂水平。

２．３ 血液中氧化水平相關指標測定

為了進一步評價高脂飼料對豬體氧化水平的影響，本試驗選取測定ＳＯＤ酶活性和ＰＯＮ１酶活性來判斷（圖３）。從圖３可以看出，相對于對照組，高脂組的ＳＯＤ酶活性和ＰＯＮ１酶活性均明顯降低，在１６周后下降趨勢維持在一個穩定的狀態。相對于對照組，高脂組中ＳＯＤ酶活性最低值出現在２４周，為（７３．５４±１４．３２） Ｕ／ｍＬ，僅為同時期對照組的６４．９％（Ｐ＜０．０１）；而ＰＯＮ１酶活性最低值出現在３２周，為（６．１３±０．１５） Ｕ／Ｌ，為同時期對照組的８０．９％（Ｐ＜０．０１）。香豬血液中的ＳＯＤ和ＰＯＮ１酶活性的降低說明高脂飼料增加了豬體的氧化水平。

３ 小結與討論

動脈粥樣硬化（Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＳ）發病機理十分復雜，目前尚未完全闡明［２］。越來越多的證據表明ＰＯＮ1在脂蛋白代謝中起著重要作用，并進而影響冠心病和動脈粥樣硬化的發生。人類ＰＯＮ1在血液中結合ＡｐｏＡＩ而緊密固定在高密度脂蛋白顆粒上發揮抗氧化作用，抑制低密度脂蛋白氧化修飾以及水解溶血磷脂等具有生物活性的脂質過氧化物，是重要的抗氧化酶［３］。動物試驗表明剔除ＰＯＮ１基因的實驗鼠經過高脂喂食后，其高密度脂蛋白和低密度脂蛋白較對照鼠更易于受到氧化攻擊，而ＰＯＮｌ過度表達的鼠類動脈粥樣斑塊明顯減少［４］。又據報道，ＰＯＮ１在糖尿病和心血管系統等疾病中活性明顯下降，也有力地支持ＰＯＮ1的抗氧化作用［５］。可見在正常生理情況下，人體內存在許多抗氧化劑和抗氧化酶能夠有效及時地清除氧自由基而維持動態平衡，但其分子機制有待進一步研究。豬動脈粥樣硬化形成過程和解剖特征與人極為相似，可作為研究ＡＳ的理想模型。

本試驗中建立的貴州小香豬模型隨著時間的推移，其體重、血清ＴＣ、ＬＤＬ、ＨＤＬ均明顯升高，說明高脂食品飼喂加速了小香豬動脈粥樣硬化進程。在此過程中，高脂飼喂使香豬體內脂質過氧化物積聚，引發氧化應激反應，抑制ＳＯＤ、ＰＯＮ１酶活性。另一方面，試驗中觀察到１６周為一分水嶺，在１６周后，血清ＴＣ有小幅降低并維持在一個相對穩定的水平，ＳＯＤ、ＰＯＮ１酶活性也不再下降，維持在一個相對穩定的狀態，這是一種生理適應。因此，ＳＯＤ和 ＰＯＮ１活性下降加速自由基產生，引發細胞內大分子物質核酸、蛋白質和脂肪酸發生一系列氧化損傷，可能是動脈粥樣硬化的主要發病機制。本試驗建立了貴州小香豬動脈粥樣硬化模型，為研究ＰＯＮ１作用與脂質代謝之間的關系提出了新的研究方法和思路。

參考文獻：

［１］ 呂國才，馬成堅，徐根云，等． 血清中對氧磷脂酶１活性的自動化檢測［Ｊ］． 上海醫學檢驗雜志，２００３，１８（５）：２７５－２７７．

［２］ ＷＡＬＴＥＲ Ｍ． Ｉｎｔｅｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ＨＤＬ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ａｇｉｎｇ， ａｎｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ［Ｊ］． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２００９， ２９（９）：１２４４－１２５０．

［３］ ＳＡＮＺ Ｐ， ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ－ＶＩＮＣＥＮＴ Ｍ Ｃ， ＤＡＩＺ Ｄ，ｅｔ ａｌ． Ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｂｌｏｏｄ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ： ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｖａｒｉａｎｃｅｓ［Ｊ］． Ｃｌｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｌ，１９９１，２９：８１－９０．

［４］ ＳＨＩＨ Ｄ Ｍ，ＧＵ Ｌ，ＸＩＡ Ｙ Ｒ，ｅｔ ａｌ. Ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｓｅｒｕｍ ｐａｒａｏｘｏｎａｓｅ ａｒｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９４（６６９０）：２８４－２８７．

［５］ 蔣興亮，龔國忠，周京國，等． 血清對氧磷酯酶１活性在各類肝損害病程中的變化及意義［Ｊ］． 中國臨床醫學， ２００６， １３（４）：５８４－５８６．