3齡思茅松毛蟲幼蟲腸道好氧細菌的分離及ARDRA多態性分析

摘要：從３齡思茅松毛蟲（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）幼蟲腸道樣品中分離得到１１株好氧細菌。以細菌基因組ＤＮＡ為模板，擴增１６ Ｓ ｒＤＮＡ，并用４種限制性內切酶Ｈａｅ Ⅲ和Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｈｉｎｆ Ⅰ和Ｔａｑ Ⅰ對ＰＣＲ擴增產物進行ＡＲＤＲＡ多態性分析。對聚類圖譜的分析結果發現１１株好氧細菌在７０％的遺傳相似度水平上聚成４個不同分類操作單元（ＯＴＵ），表明３齡松毛蟲中腸道內好氧細菌的遺傳多樣性水平偏低。

關鍵詞：腸道細菌；多樣性；ＡＲＤＲＡ；思茅松毛蟲（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）

中圖分類號：Ｑ９３９．１２１；Ｑ９６８．１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）07－1481-03

Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Inｔｅｓｔｉｎａｌ Ａｅｒｏｂｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ３ｔｈ Ｉｎｓｔａｒ

Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ Ｌａｒｖａｅ ｂｙ ＡＲＤＲＡ

ＫＡＮＧ Ｌｉｕ，ＷＡＮＧ Ｊｉｎ－ｈｕａ，ＳＵＮ Ｙｏｕ－ｈｅ，ＧＡＯ Ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ／ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： １１ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｏｆ ３ｔｈ instar Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕ ｋｉｋｕｃｈｉｉ ｌａｒｖａｅ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ， １６ Ｓ ｒＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ． ４ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｈａｅ Ⅲ ａｎｄ Ｈｉｎｄ Ⅲ， Ｈｉｎｆ Ⅰａｎｄ Ｔａｑ Ⅰ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ＡＲDＲＡ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ １１ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ４ ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔs（ＯＴＵs） ｏｎ ７０％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｌｅｖｅｌ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｅｒｏｂｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ’s ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ３ｔｈ instar Ｄ． ｋｉｋｕｃｈｉｉ ｌａｒｖａｅ ｗａｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｏｗ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ； ＡＲＤＲＡ； Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕ ｋｉｋｕｃｈｉｉ

思茅松毛蟲（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ ｋｉｋｕｃｈｉｉ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）隸屬鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）枯葉蛾科（Ｌａｓｉｏｃａｍｐｉｄａｅ）松毛蟲屬（Ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ），在我國云南地區分布廣泛［１］，為害馬尾松、思茅松、云南松等，其體型大，幼蟲齡期長，取食量大，是我國南方松樹的重要害蟲之一。目前松毛蟲防治主要采用天敵、化學農藥和綠僵菌等措施，環境污染嚴重，效果受天氣影響較大，因此大力開發穩定性較好的生物農藥非常必要。

昆蟲腸道中存在的微生物菌群與昆蟲的營養、免疫等生理活動密切相關。腸道微生物的改變直接影響昆蟲的進食、生長發育，近年來已成為研究的熱點。國內對昆蟲腸道微生物的研究主要集中在家蠶、桑粒肩天牛、中華真地鱉、東亞飛蝗和黑粉蟲等［２－９］，而松毛蟲腸道微生物的研究報道較少。

原核生物１６ Ｓ ｒＤＮＡ區段保守性高、攜帶的信息量大，用ＡＲＤＲＡ（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒＤＮＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）多態性分析的方法可以十分方便地對分離的菌株進行類群劃分，簡化傳統分類鑒定方法的繁瑣過程［１０］。因此，實驗菌株１６ Ｓ ｒＤＮＡ的擴增及酶切圖譜可以有效地反映細菌的多樣性。本實驗通過研究松毛蟲腸道內好氧細菌的多樣性，為研究松毛蟲與腸道微生物的關系提供科學依據；為后期利用腸道弱勢菌群飼喂松毛蟲，改變其腸菌多樣性，影響其生長發育、殺蟲等提供種質資源，以期開發出新的殺蟲效力穩定的生物殺蟲劑。

１ 材料與方法

１．１ 樣品的采集

于２０１１年３～５月采集西南林業大學后山的健康思茅松毛蟲。將采集的思茅松毛蟲養殖在適度條件下的網狀養殖箱內，每天更換新鮮的松樹枝。用游標卡尺測量思茅松毛蟲的大小，３齡思茅松毛蟲體長為９．０～１１．０ ｍｍ、頭寬１．５～２．５ ｍｍ，選取健康的３ 齡思茅松毛蟲為本實驗的樣品。

１．２ 培養基與試劑

平板分離培養基采用營養肉湯培養基，純化培養基采用牛肉膏蛋白胨培養基；細菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒、ＰＣＲ試劑、限制性內切酶等購自天根生化科技（北京）有限公司。

１．３ 細菌的分離和純化

將３齡松毛蟲用無菌水飼養３ ｄ，排盡其腸道食物。將蟲體于升汞溶液中浸泡１０ ｓ，期間用鑷子翻動蟲體，使消毒徹底。再用無菌水沖洗蟲體５ ｍｉｎ，重復３次。在無菌條件下解剖松毛蟲取中腸，研磨搗碎后加１ ｍＬ無菌水制成腸道勻漿懸液，備用。

將腸道勻漿懸液按１×（１０－１～１０－８）用無菌水倍比稀釋，各取１ ｍＬ涂布于營養肉湯培養基上，置于２８ ℃培養箱中暗培養７ ｄ。挑取單菌落在牛肉膏蛋白胨培養基平板上劃線純化。純菌株于４ ℃斜面保藏。每處理重復３次。

１．４ 菌體基因組ＤＮＡ的提取

用細菌基因組ＤＮＡ提取試劑盒提取好氧細菌單菌落的基因組ＤＮＡ。

１．５ １６ Ｓ ｒＤＮＡ的擴增

以１６ Ｓ ｒDＮＡ的通用引物進行ＰＣＲ擴增，引物序列為：正向引物２７ｆ（５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′）和反向引物１４９２ｒ（５′－ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３′）。反應體系為：１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ，ＭｇＣｌ２ ３ μＬ，ｄＮＴＰs １ μＬ，引物各１ μＬ，ＤＮＡ模板１ μＬ，Ｔａｑ酶（５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，無菌水補足５０ μＬ。反應程序：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變化１ ｍｉｎ，５６ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸３ ｍｉｎ，３０個循環；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ。０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＰＣＲ產物。

１．６ ＡＲＤＲＡ分析

１．６．１ 酶切 用兩組４種限制性內切酶對１６ Ｓ ｒDＮＡ基因擴增產物進行酶切。①ＨａｅⅢ 和 ＨｉｎｄⅢ的酶切。反應體系：ＨａｅⅢ １ μＬ，Ｈｉｎｄ Ⅲ １ μＬ，１０×Ｍ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，ＤＮＡ １０ μＬ，滅菌水補足２０ μＬ。反應條件：３７ ℃過夜，０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。②ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ的酶切。反應體系：ＨｉｎｆⅠ１ μＬ，ＴａｑⅠ１ μＬ，１０×ＴａｑⅠＢａｓａｌ Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ，０．１％ＢＳＡ ２ μＬ，ＤＮＡ １０ μＬ，滅菌水補足２０ μＬ。反應條件：３７ ℃ ２～３ ｈ，６５ ℃ ２ ｈ，０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。

１．６．２ 多態性分析 用軟件Ｌａｂｉｍａｇｅ ２．０將瓊脂糖凝膠上出現的ＤＮＡ帶譜轉化為分子量信息，按“出現”記為１，“不出現”記為０，進行統計。模糊條帶及分子量小于８０ ｂｐ的條帶忽略不計。根據條帶數目及分子量大小進行分析，用ＭＶＳＰ軟件將０，１數據處理為０，１矩陣；進行ＵＰＧＭＡ分析，構建聚類樹。

２ 結果與分析

２．１ ３齡松毛蟲腸道好氧細菌的分離

３齡松毛蟲中腸道勻漿懸液經倍比稀釋涂布培養后，共分離得到１１株好氧細菌，編號為１～１１。

２．２ １６ Ｓ ｒＤＮＡ擴增結果

以提取的１１株分離菌株基因組ＤＮＡ為模板擴增１６ Ｓ ｒＤＮＡ，得到重復性好、穩定清晰的特異片段，見圖１。電泳結果顯示ＰＣＲ擴增出了長度約為１．５ ｋｂ的細菌１６ Ｓ ｒＤＮＡ近似全序列。

２．３ ３齡松毛蟲腸道好氧細菌的ＡＲＤＲＡ分析

ＡＲＤＲＡ可在１６ Ｓ ｒDＮＡ基因序列上區分細菌種的差異；每１個１６ Ｓ ｒＤＮＡ限制片段長度多態性類型代表了一個操作分類單位（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ， ＯＴＵ），用這種方法顯示的ＯＴＵｓ多樣性能用以估計分離物中存在的最低限度的細菌種的數目［１０］。用限制性內切酶Ｈａｅ Ⅲ和Ｈｉｎｄ Ⅲ對ＰＣＲ產物進行ＡＲＤＲＡ多態性分析，１１個菌株共顯示了３種不同的ＡＲＤＡＲ譜帶類型（圖２Ａ），即得到了３個ＯＴＵｓ，表明至少存在３種不同的細菌。用ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ對ＰＣＲ產物進行ＡＲＤＲＡ多態性分析，１１個菌株共顯示了５種不同的ＡＲＤＡＲ譜帶類型（圖２ Ｂ），即得到了５個ＯＴＵｓ。電泳圖譜表明，ＨｉｎｆⅠ和ＴａｑⅠ的酶切圖譜多樣性更豐富，較適用于昆蟲腸道細菌的鑒定。根據Ｈｉｎｄ Ⅲ、Ｈａｅ Ⅲ、ＨｉｎｆⅠ及ＴａｑⅠ４種內切酶酶切結果，對１１株菌進行ＵＰＧＭＡ分析，得到聚類樹（圖３）。由圖３可知，３齡松毛蟲腸道的１１株好氧細菌在７０％的遺傳相似度水平上聚成4個類群，第Ⅰ類群有５株，占４５．４５％，為３齡松毛蟲腸道優勢菌群；第Ⅱ類群與第Ⅳ類群各有１株，占９.09％，為３齡松毛蟲腸道弱勢菌群；第Ⅲ類群有４株，占３６．３６％。ＡＲＤＲＡ分型結果初步表明，３齡松毛蟲腸道好氧細菌群落的相似度很大，遺傳多樣性水平偏低。

３ 討論

動物腸道內的細菌密度是所有生態環境里最大的，但是類別卻是最簡單的［2］。本實驗從３齡松毛蟲腸道中共分離得到可培養的好氧細菌１１株，經ＡＲＤＲＡ聚類分析，在７０％的遺傳相似度水平上歸屬４個類群，說明３齡松毛蟲腸道內好氧細菌的多樣性水平偏低，這可能是因為松毛蟲的草食性生活習性建立了腸道特定的營養環境，腸道微生物也通過復雜的調控過程形成了具有一定穩定性的微生物群系。而這個微生物群系可能根據食物和進入的微生物的特點而發生變化。因此后期試驗將利用松毛蟲腸道弱勢菌群培養物噴灑無菌草葉飼喂松毛蟲，觀察弱勢菌群對松毛蟲腸道微生物多樣性的影響，分析腸道微生物多樣性的變化對松毛蟲個體生長發育及代謝的影響，以期找到松毛蟲生物防治的新方法，達到預防和控制的目的。

本研究分離得到的各種好氧細菌菌株的系統發育關系，以及各自分類地位的鑒定等有待于后續研究。

參考文獻：

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