辛伐他汀對人牙髓干細胞增殖和分化的影響

[摘要]目的：研究辛伐他汀對人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）增殖和成骨分化的影響。方法：將第3代人DPSCs在礦化培養液中誘導培養，同時加入不同濃度的辛伐他汀（1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L），噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測細胞增殖情況，堿性磷酸酶試劑盒檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，茜素紅染色鑒定成骨分化。結果：各濃度辛伐他汀均抑制人DPSCs增值，辛伐他汀濃度為1×10-5mol/L時，抑制作用最明顯。適宜濃度辛伐他汀（1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L）促進人DPSCs向成骨細胞分化，其中，1×10-7mol/L的辛伐他汀促進ALP活性的作用最明顯。結論：辛伐他汀抑制人DPSCs的增值，適宜濃度的辛伐他汀可有效促進人DPSCs的成骨分化。

[關鍵詞]辛伐他汀；牙髓干細胞；增殖；分化

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）02-0263-04

辛伐他汀是脂類代謝途徑中的限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglut aryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑，臨床常用于降低膽固醇、降低血脂，減少心臟病的發生[1]。1999年Mundy在Science發表文章，報道辛伐他汀在骨代謝方面的影響，其實驗研究發現，辛伐他汀可顯著增加成骨細胞數量，減少破骨細胞數量，促進松質骨骨量增加，證明辛伐他汀具有良好的促進骨修復的性能[2]。此后，國內外學者也通過多項實驗證實了辛伐他汀的促成骨分化特性。但以往的研究表明，不同的他汀類藥物對不同類型的細胞，其增殖效應是不同的。他汀類藥物可能抑制平滑肌細胞和內皮細胞的增殖，但卻可以提高成纖維細胞的有絲分裂活性。故本實驗采用噻唑藍法、堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色等多種方法，研究辛伐他汀對人牙髓干細胞增值及分化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料：胎牛血清（Hyclone，美國）；DMEM F/12（Gibco，美國）培養基；3mg/ml Ⅰ型膠原酶（Gibco，美國）；0.25% 胰酶（碧云天生物技術研究所，上海）；青鏈霉素（碧云天生物技術研究所，上海）；PBS緩沖溶液；100μmol/L 抗壞血酸（sigma，美國）；10mmol/L β-甘油磷酸鈉（sigma，美國）；2mmol/L L-谷氨酰胺（sigma，美國）；茜素紅（Sigma，美國）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；噻唑藍（Amresco，美國）；辛伐他汀（sigma，美國）；二甲基亞砜（sigma，美國）；Triton X-100（碧云天生物技術研究所，上海）。

1.2 人牙髓干細胞分離培養及傳代：選擇哈爾濱醫科大學附屬第二臨床醫院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據Gronthos DPSCs 原代細胞培養法[3]，劈開實驗牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗，置于體積分數為0.3%的Ⅰ型膠原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃橫濕振蕩器內消化1h，200目尼龍篩過濾懸液至10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入含20%FBS培養基，吹打混勻，血球計數板計數以1×108個/L細胞接種至50ml培養瓶，37℃，5%CO2恒溫培養箱中培養。每周換液兩次，細胞融合達80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2比例傳代。

1.3 DPSCs鑒定：克隆團分選技術將DPSCs懸液進行純化分離，流式細胞技術鑒定DPSCs，倒置顯微鏡觀察細胞形態，細胞常規傳代至第3代用于后續實驗[4-5]。

1.4 MTT染色實驗：將DPSCs以5×103個/孔接種在九十六孔板中，在37℃、體積分數為5%C02飽和濕度條件下，于礦化培養液中（DMEM F/12培養基、胎牛血清、青鏈霉素、100μmol/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，2mmol/L L-谷氨酰胺[6-7]），分A、B、C、D、E五組，加入不同濃度辛伐他汀，進行細胞培養。各組辛伐他汀濃度為A組：1×10-5mol/L；B組：1×10-6mol/L； C組：1×10-7mol/L； D組：1×10-8mol/L；E組：0 mol/L。于細胞培養第3天加入MTT 20μl，37℃孵育4h，吸去孔內培養基，每孔加入二甲基亞砜150μl，培養板均勻振蕩10min，自動酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（A）值，觀察各組細胞增值情況。

1.5 ALP活性測定：細胞培養條件同MTT實驗，細胞培養分為ABCD四組，各組辛伐他汀濃度為：A組：1×10-6mol/L；B組：1×10-7mol/L； C組：1×10-8mol/L； D組：0 mol/L。培養3天時，去除培養板中培養液，0.01mol/L PBS沖洗細胞3次，加入50μl 0.1% Triton X-100，4℃冰箱過夜，光鏡下觀察已無明顯細胞結構，反復吹打后每個樣本加入ALP緩沖液和基質液各50μl，充分混勻，37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，在酶標儀上選擇520nm波長檢測各孔A值。觀察各組細胞ALP活性，找出辛伐他汀誘導DPSCs成骨分化的最佳濃度。

1.6 茜素紅鈣結節染色：將DPSCs以1×105個/孔接種于六孔板中，細胞分組及培養條件同ALP檢測實驗。DPSCs于14天進行茜素紅染色，培養皿PBS緩沖液沖洗3遍，95%無水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris-HCl（pH=8.3）37℃，30min，蒸餾水輕輕沖洗，干燥。

1.7 統計學分析：使用SPSS 15.0統計學軟件，計量資料采用“均值±標準差”形式描述。

對實驗組與對照組檢測結果進行t檢驗和方差分析。

2 實驗結果

2.1 DPSCs光學顯微鏡下細胞形態學變化：DPSCs原代培養24h內細胞貼壁緩慢，可見細胞為梭形，形態較小，未完全伸展，且有少量懸浮未貼壁細胞。48h，細胞梭形，貼壁較多，少量細胞呈克隆團狀生長，見圖1。7天后可見DPSCs大量擴增，呈伸展長梭形，克隆團狀聚集生長，細胞融合率可達80%。

2.2 辛伐他汀對DPSCs增殖能力的影響：與對照組E組比較，A、B、C、D四組辛伐他汀對細胞增值均有一定的抑制作用，其中A組、B組、C組與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05），因為A組明顯抑制DPSCs的增殖，此濃度不用于后續實驗，見表1。

2.3 辛伐他汀對DPSCs堿性磷酸酶活性的影響：A、B、C組測得的A值明顯高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。其中，B組對ALP活性的促進作用最顯著。見表2

2.4 辛伐他汀對DPSCs礦化的影響：DPSCs 14天培養后，可見部分細胞發生成骨細胞樣多角形以及錐體形態改變。DPSCs在礦化誘導后逐漸產生白色點狀晶體。經茜素紅染色后光學顯微鏡下均可見橘紅色礦化結節，呈團狀不規則形態。如圖3。

3 討論

實驗研究表明，DPSCs可向神經細胞、脂肪細胞、肌細胞、成骨細胞等多種細胞分化[8-13]，擁有多向分化的潛能，它可以作為一種組織工程的種子細胞，用于頜骨缺損的修復治療。目前，各種藥物、細胞因子及可溶性蛋白的添加廣泛用于誘導DPSCs的骨向分化，如抗壞血酸、血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子等[11-13]。辛伐他汀作為一種新發現藥物，已被證實具有促進成骨的活性。Wang PS等人的多項統計分析表明，辛伐他汀可以明顯提高絕經后婦女和老年人的骨密度， 降低骨折發生的比例[14-16]。Maeda 等研究辛伐他汀對非轉化成骨樣細胞（MC3T3-E1）和鼠骨髓細胞的影響，發現辛伐他汀能提高成骨細胞ALP活性和促進礦化結節形成[17]。

在骨形成過程中，成骨細胞的演化經歷細胞增殖、細胞外基質成熟、礦化和細胞凋亡4個不同階段，各階段調控精細，不同標志物特異性表達。ALP的表達是成骨細胞分化的主要特征之一，是基質成熟的早期標志物，其作用是水解有機磷酸釋放出無機磷，促使基質礦化[18-19]。ALP是骨形成所必需的酶，它的表達表明細胞分化和骨組織形成的開始，代表著骨形成的狀況。礦化能力是干細胞成骨的重要特性之一，組織內的鈣質大部分以磷酸鈣或碳酸鈣的形式存在，茜素紅AR-S法通過鈣離子與茜素紅特異性結合，可使礦化結節呈現鮮紅色，因此茜素紅染色是鑒定成骨分化的較特異的方法。

本實驗采用MTT法、ALP試劑盒、茜素紅染色法檢測辛伐他汀對人牙髓干細胞的影響。結果顯示，辛伐他汀抑制牙髓干細胞的增值，但對牙髓干細胞向成骨細胞分化具有促進作用。預示該藥具有骨缺損治療的臨床應用前景，為頜骨骨缺損的組織工程修復提供了理論依據。辛伐他汀對人牙髓干細胞影響的研究還不成熟，本實驗只是進行了初步的探討，具體的藥物濃度、作用方式和作用機制還有待進一步研究。

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[收稿日期]2012-11-13 [修回日期]2013-01-18

編輯/張惠娟