嘉峪關魏晉墓腐蝕壁畫真菌群落組成分析

內容摘要：微生物腐蝕與降解是嘉峪關魏晉墓磚壁畫保存過程中所面臨的主要問題之一。本研究采用現代分子生物學技術，對造成魏晉墓磚壁畫腐蝕的真菌類群進行了檢測和分析。通過樣品總DNA提取，目標片段擴增，克隆文庫構建，序列測定與比對后發現，魏晉墓腐蝕磚壁畫真菌序列主要隸屬于曲霉屬、Phialosimplex屬和側齒霉屬。常年受人為擾動，墓室內腐蝕磚壁畫真菌多樣性下降，群落結構發生改變。墓室常年開放或常年關閉均不利于磚壁畫的長久保存。分子技術在快速、準確檢測壁畫微生物群落組成方面優勢明顯，應加以推廣應用。

關鍵詞：魏晉墓；磚壁畫；微生物腐蝕；分子檢測；真菌類群；文物保護

中圖分類號：K854.3 文獻標識碼：A 文章編號：1000-4106（2013）01-0060-07

1 引言

關于壁畫和歷史遺跡表面微生物生態學及其環境保護的研究可以追溯到20世紀50年代末期。由于不同類型壁畫的制作材質和工藝不同，其附存的環境多種多樣，因而與它們相關聯的生物群落也存在很大差異[1-3]。已有研究表明，腐蝕壁畫微生物主要有以青霉屬、曲霉屬、枝孢霉屬和Engyodontium為主的真菌[4]，以芽孢桿菌屬、節桿菌屬、微球菌屬和假單胞菌為主的細菌[5]，以念珠藻屬、鞘絲藻屬和綠球藻屬為優勢種屬的藻類[6]，以鏈霉菌屬和諾卡氏菌屬為主的放線菌[7]及殼狀地衣[8]等。這些微生物的生長和代謝不僅會影響壁畫的美學價值，而且會造成壁畫的結構性損壞[9，10]。

旅游開放對洞窟環境影響方面的研究是近年來文物保護領域關注的熱點。法國拉斯科史前洞穴在1948年開始對游客開放，但于1963年被迫關閉。究其原因，是游客參觀訪問改變了洞穴內原有環境，導致不同類型的微生物相繼爆發，影響到壁畫的色度和結構[10]。同樣，光合細菌和異養微生物的蔓延使得西班牙阿爾塔米拉史前洞穴自2002年停止對游客開放，經過一系列環境控制后，巖洞是否可以重新開放尚待進一步的科學評估[11]。埃及圖坦卡門墓經過近30年的旅游開放，墓穴壁畫保存環境日益惡化，微生物污染問題嚴重，在近期不得不宣布暫停對游客開放[12]。與此同時，許多珍貴的洞窟已經禁止參觀并被完全封閉，以期恢復洞窟中原有的生態環境系統[13]。研究發現，游客的進出對莫高窟洞窟內空氣微生物群落的組成和結構影響很大[14，15]。這些研究成果均表明游客的參觀活動對壁畫原有保存環境產生了極大的擾動，并對其原本脆弱的生態系統造成了嚴重的沖擊。

近年來，分子生物學檢測方法因其敏感性和不依賴于樣品中微生物的培養而廣受研究者青睞，因其可在短期內得到腐蝕微生物群落組成和結構方面的重要信息[16-18]。截至目前，國內對腐蝕壁畫微生物類群的研究還較少[9]，對于墓室這種特殊環境下的微生物調查則更少[19]。本研究利用分子生物學檢測技術對被譽為“世界最大的地下畫廊”的嘉峪關魏晉壁畫墓（六號墓和七號墓）內腐蝕壁畫的真菌進行了檢測，對腐蝕壁畫的真菌群落組成進行了分析。本研究將為國內開展文物的微生物腐蝕監測提供新的理論依據與技術支撐，有利于墓室環境下微生物腐蝕機理的深入研究和文化遺產的長久保存。

2 樣地簡介與實驗方法

2.1 樣地簡介

嘉峪關魏晉磚壁畫墓位于甘肅嘉峪關市東北20公里的新城戈壁灘上，古墓群分布長達20多公里。六號墓和七號墓相距約500米，發掘于1972-1973年間。目前六號墓對外開放，七號墓暫未開放參觀。前期現狀調查發現，兩座墓均存在構造磚受壓裂縫、破損和脫落，局部顏料層產生起甲、酥堿甚至脫落現象，部分磚壁畫表面存在微生物菌斑等病害。

2.2 實驗方法：

（1）樣品采集及總DNA提取

在壁畫微生物病害區域，用無菌解剖刀刮取少量帶有菌斑的磚壁畫樣品，裝入無菌Eppendorf管中，用分析天平稱取0.1g，使用PowerSoilTM（MOBIO Laboratories，Solanabeach，CA，USA）DNA提取試劑盒，根據操作說明完成腐蝕壁畫微生物總DNA的提取，分裝后置于-20℃保存備用。

（2）目標片段擴增

以總DNA為擴增模板，真菌rRNA 基因內轉錄間隔區（ITS）擴增選擇通用引物ITS1和ITS4 [20]。反應體系（25μl）包括1U的Taq聚合酶，終濃度為0.2mM的dNTP，2.5μl10×反應緩沖液，單條引物濃度0.2mM，以及2.0μl模板（大約含有10ng DNA）。擴增程序為：預變性94℃5min，然后在94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，完成30個擴增循環，終延伸72℃10min。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段的大小與特異性。

（3）克隆文庫構建

使用瓊脂糖DNA純化試劑盒對擴增產物進行純化。取純化后產物7ul，與pGM-T載體連接，并克隆至 E.coli DH-5α受體菌制備的感受態細胞中（Tiangen Co.， Beijing， China）。根據藍白斑篩選平板（LB中AMP濃度為100 μg ml-1， X-Gal為60μg ml-1， IPTG為20μg ml-1），每一轉化平板挑取150-250個白斑，用T7-SP6引物直接擴增驗證插入片段大小是否合適。將確定無誤后的陽性克隆斑挑至液體LB培養基中（含Amp 12μg ml-1）37℃過夜培養，吸取1ml菌液送交測序公司完成序列測定（ShangHai Majorbio Bio-technology Co.， Ltd.）。

（4）測序及序列比對

測定序列使用 CONTIGEXPRESS 軟件進行編輯（Informax， MD， USA），使用嵌合體檢測系統在線完成嵌合體檢測[21]。所得序列在基因數據庫GenBank[22]中完成比對和相似序列的篩選。利用BLAST程序在GenBank序列數據庫中與已知類群真菌的ITS基因序列進行比較。

3 實驗結果

3.1 克隆文庫序列比對

通過構建克隆文庫，嘉峪關六、七號墓腐蝕磚壁畫上分別得到真菌ITS序列138條和224條。六號墓腐蝕磚壁畫樣品中共得到典型真菌序列3類，七號墓腐蝕磚壁畫樣品中共得到真菌序列14類。在NCBI數據庫中對每類序列進行比對，所得信息如表1所示。

3.2 腐蝕磚壁畫微生物群落組成

通過對微生物腐蝕磚壁畫樣品克隆文庫中典型序列進行NCBI比對，六號墓內所獲真菌序列隸屬于曲霉屬和Phialosimplex屬，其中曲霉屬占絕對優勢，克隆子數占總克隆數的75%（圖1）。

七號墓內所獲真菌序列隸屬于曲霉屬、側齒霉屬、青霉屬、枝孢屬、白僵菌屬和未鑒定不可培養真菌種屬，其中曲霉屬和側齒霉屬為優勢屬，克隆子數占總克隆數百分比分別為35%和23%。

4 討論

研究結果表明，六號墓微生物腐蝕磚壁畫樣品中共得到典型真菌序列2類，主要隸屬于曲霉屬和Phialosimplex屬，其中曲霉屬占絕對優勢（75%）。七號墓微生物腐蝕磚壁畫樣品中共得到典型真菌序列14類，至少隸屬于6個真菌屬，其中曲霉屬（35%）和側齒霉屬（23%）為優勢屬。整體而言，六號墓腐蝕磚壁畫克隆文庫中所得真菌類型低于七號墓，群落組成相對簡單，多樣性低。前期研究發現，六號墓腐蝕磚壁畫細菌多樣性比七號墓低[19]。造成這種情況的原因可能是六號墓長期對外開放，墓室內外空氣流通和交換速率相對較快，不利于多數微生物在壁畫磚表面生長、繁殖和蔓延。有研究表明，在有游客參觀時，洞窟大小與洞窟空氣交換速率具有指數相關性[23]。七號墓常年關閉，內部環境受外界的擾動相對較小，是墓室內微生物多樣性較高的可能原因。20世紀70年代中期，七號墓墓室曾發生過洪水的滲入，而洪水本身會將外界豐富的有機質帶入寡營養的墓室環境，整個墓室內營養鏈會發生改變，這就為不同類型微生物的建殖和生長提供了有利條件[24]。

由于六、七號壁畫墓相距僅500多米，所處地理氣候環境非常接近，二者最大的差異是旅游開放與關閉，游客參觀可能是導致六號墓磚壁畫上微生物群落結構發生改變的根本原因。有研究發現，游客參觀時呼出的CO2氣體、水汽及人體自身產生的揮發性氣體等因素是影響魏晉磚壁畫色變的主要原因，且水汽是最大的媒體介質[25]。同時，游客參觀也會引起洞穴內微生物群落結構發生改變，拉斯科洞穴內變形菌門微生物已從旅游開放前的45-50% 增加到98%[26]。因游客參觀而導致洞窟及墓室壁畫遭受微生物侵染的案例已經很多[10-13]，西班牙天然遺跡Casta？觡ar de Ibor 洞穴自2003年對外開放后，因游客參觀帶入碎屑而導致卷枝毛霉和鐮刀霉菌大肆爆發[18]。因此，地下墓室的旅游關閉對維持壁畫表面原有生物群落多樣性及生態系統穩定性具有重要作用，但長期關閉易造成地下墓室空氣交換不良，對墓室壁畫保存構成了潛在的威脅。因此，墓室常年開放或常年關閉均不利于磚壁畫的長久保存。建議根據墓室內溫濕度監測數據，制訂墓室打開的時間周期方案，以促使墓室內外空氣的交換和流通，確保磚壁畫的合理保護。

本研究中，曲霉屬、Phialosimplex屬和側齒霉屬為魏晉墓腐蝕磚壁畫上的優勢屬。而在西班牙La Rabida 修道院，從壁畫上分離出的優勢真菌主要為枝孢屬、側齒霉屬和曲霉屬[9]，這與本研究結果非常接近。在河南密縣漢墓壁畫上，利用基于培養的方法分離得到的真菌主要有青霉屬、擬青霉屬和曲霉屬[27]；敦煌莫高窟壁畫表面培養分離得到的霉菌包括青霉屬、曲霉屬、枝孢霉屬、鏈格孢屬、根霉屬，其中優勢菌為青霉屬[3]；從西安曲江翠竹園西漢墓壁畫上分離得到的霉菌主要有青霉屬、擬青霉屬、曲霉屬[28]；而之前研究表明，嘉峪關壁畫墓分離得到的霉菌主要有青霉屬、交鏈孢屬、被孢霉屬、和曲霉屬[29]。Guglielminetti 等（1994）發現，意大利阿西西 St. Damian修道院濕壁畫主要受到了枝孢屬、曲霉屬、鏈格孢屬、青霉屬、和鐮刀菌屬真菌的侵染[30]。側齒霉屬（23%）在七號墓壁畫上占據一定優勢，其在壁畫的微生物腐蝕過程中可能發揮著至關重要的作用。Karpovich-Tate和Rebrikova[31]通過對俄羅斯波洛夫斯科Pafnutiyev修道院壁畫表面微生物調查發現，白色側齒霉菌（Tritirachium album）占到分離微生物的90%，在斯洛伐克17世紀建筑體潮濕墻壁上，也發現了白色側齒霉菌[32]。Gorbushina與Petersen通過對德國大量壁畫研究后發現，白色側齒霉菌和球孢枝孢菌是壁畫上普遍性存在的真菌[33]，可以作為壁畫被微生物侵蝕的一個判斷標準。

NCBI序列比對發現，與真菌ITS克隆文庫中序列相似的基因文庫序列大多與分離自螞蟻共生菌、植物內生菌、及動物致病菌相似。大量研究資料表明，古壁畫上的真菌與節肢動物有關[34]。節肢動物與大氣微粒是否為本研究中腐蝕壁畫微生物的主要傳播源尚需進一步研究證實。

由此可見，不論是采用傳統的分離鑒定手段，還是現代分子生物學鑒定技術，曲霉屬與側齒霉屬在腐蝕壁畫微生物類群中均占據著重要地位。本研究中分子檢測結果與傳統富集分離培養手段所獲結果具有一定的差異，這與檢測技術本身密切相關。首先，傳統的富集培養手段只能得到1%左右的壁畫微生物類群，而可能與壁畫色變和老化有關的其他99%的微生物難以恢復培養，無法真正體現壁畫上生存的微生物多樣性[35]。其次，壁畫微生物類群存在時間和空間上的動態變化和演替過程，微環境改變或營養源的變化都會使整個微生物群落結構發生新的變化[9]。現代分子生物學技術在腐蝕微生物群落的快速、準確檢測方面具有傳統培養分離手段無可替代的優勢，在生物腐蝕機理的深入研究方面也具有良好的應用前景。

5 結論

（1）受旅游參觀影響，魏晉六、七號墓壁畫上腐蝕真菌群落組成差異明顯。

（2）曲霉屬、Phialosimplex屬和側齒霉屬為魏晉墓腐蝕壁畫上的優勢屬。

（3）曲霉屬、側齒霉屬真菌可以作為壁畫受微生物腐蝕狀況的指示子。

（4）現代分子生物學技術在腐蝕微生物群落快速、準確檢測方面具有良好的應用前景。

致謝：特別感謝嘉峪關新城魏晉墓文管所工作人員在采樣過程中給予幫助，感謝敦煌研究院保護研究所保護科學室徐瑞紅等在實驗過程中給予幫助。

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