抗結腸小袋纖毛蟲中草藥的體外篩選

摘要：利用機率單位法，從30種中草藥中篩選出16種半數致死濃度（LC50）低于100 g/L的中草藥，分別是五倍子、常山、烏梅、葛根、百部、二花、甘草、黃芩、知母、檳榔、苦楝皮、訶子、貫眾、使君子、巴豆和青蒿，可作為抗結腸小袋纖毛蟲候選中草藥，做進一步研究。

關鍵詞：結腸小袋纖毛蟲；中草藥；機率單位法；半數致死濃度（LC50）

中圖分類號：S852.72 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）03-0027-02

結腸小袋纖毛蟲病（Balantidiosis）是一種人獸共患原蟲病，目前已知人及非人靈長類動物、豬等33種動物可感染該病，其中豬感染最為普遍，是人和其他動物感染的重要傳染源[1]。臨床上常用于該病的硝基咪唑類藥物有“三致”作用，已被要求禁用于食品動物[2]。利用體外急性毒性試驗方法，篩選可用于抗結腸小袋纖毛蟲的中草藥，為人和動物結腸小袋纖毛蟲病臨床安全用藥提供基本依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲種 試驗用結腸小袋纖毛蟲滋養體為河南科技大學寄生蟲課程組保存，是取自然發病的病豬糞便，用DMEM培養基培養后獲得的[3]。

1.1.2 試劑及藥品 DMEM培養基，10.0 g裝，Lot No.1342967，GIBCOTM，使用時按說明配成液體。五倍子、常山等30種中草藥購自北京同仁堂（洛陽）有限公司。2%甲硝唑注射液，河南華利藥業有限責任公司生產，批號為國藥準字H41020499。

1.2 方法

1.2.1 中草藥水提取物的制備 將備用的中草藥加10倍體積的水浸泡3 h，之后用砂鍋文火水煎2 h，將煎液用篩網濾出，余渣再加10倍體積水，文火水煎2 h，合并兩次煎液，再用文火濃縮到每毫升相當生藥0.5 g，高壓滅菌并冷卻后置2～8 ℃條件下備用[4]。

1.2.2 中草藥抗結腸小袋纖毛蟲效果的測定 每種中草藥煎液均設計7個不同濃度梯度，用DMEM培養液將中草藥煎液稀釋成所需濃度的兩倍。取8個滅菌小安瓿，每安瓿加培養48 h的蟲體懸液1 mL，除第一個安瓿內加1 mL DMEM培養液作為對照外，其余安瓿內分別加入相應濃度的中草藥煎液1 mL。上述小安瓿加蓋后放入28 ℃的恒溫培養箱中，2 h、6 h、12 h后取出觀察。觀察時，將每個小安瓿內液體充分混勻，吸取40 μL滴于載玻片上，加蓋玻片，于100×鏡暗視野下計數30個視野活蟲數。試驗時以甲硝唑為質控藥物，以同樣方法檢測其不同時間的半數致死濃度（LC50）。因沒有可參考的文獻資料，試驗所使用的藥物濃度梯度是在多次預試驗的基礎上確定的。所有試驗中草藥若在100 g/L濃度范圍內找到2 h半數致死濃度，則繼續尋找6 h和12 h半數致死濃度，否則不再進行試驗。

1.2.3 數據計算[5] 以對照（藥物濃度為0 g/L）樣品試驗結束時所查獲的活蟲數（30個視野）為x，以該試驗系列各樣品試驗結束時所查獲的平均活蟲數（30個視野）為y，將（x-y）/x 的數值換算為百分數，就是該濃度條件下的蟲體死亡率。根據死亡百分率-機率單位換算表，將不同濃度下死亡百分率換算成死亡機率單位。在Excel圖表系統下，以橫軸表示藥物濃度對數（lg LC50），以縱軸表示死亡機率單位，作xy散點圖。順著所獲得的散點作一趨勢線（直線），并自動獲得該直線的回歸方程。經x2檢驗回歸線符合要求后，利用該方程可求出死亡機率單位5（50 %死亡率）時的藥物濃度對數，查反對數表就可獲得LC50。利用回歸方法的斜率求出lg LC50標準誤差s，則lg LC50的95%置信限= lg LC50±1.96 s，查反對數表就可得到LC50的95%置信限。最后對中草藥效果進行比較和評價。

2 結果與分析

結腸小袋纖毛蟲滋養體具有運動性，其在藥物作用下運動能力逐漸減弱，最后停止運動，表膜破裂或消失。試驗以甲硝唑為質控藥物，試驗中發現其2、6、12 h的半數致死濃度分別是457.80 mg/L、69.05 mg/L 、25.64 mg/L，同以往報道的結果一致。黃柏、連翹 、秦皮、梔子、蒼術、苦參、白頭翁、鴉膽子、黃連、魚腥草、大青葉、公英、穿心連和仙鶴草在100 g/L的濃度范圍內均未找到半數致死濃度，其抗結腸小袋纖毛蟲效果較差。其余16種在100 g/L的濃度范圍內找到2 h半數致死濃度，并進一步確定了6 h和12 h半數致死濃度。由表1可見，2 h半數致死濃度由低到高的排序為五倍子、常山、烏梅、葛根、百部、二花、甘草、黃芩、知母、檳榔、苦楝皮、訶子、貫眾、使君子、巴豆和青蒿。6 h和12 h半數致死濃度排序與之明顯不同。

3 小結與討論

結腸小袋纖毛蟲包囊經口感染人和動物，其在消化液的作用下破裂而釋放出滋養體，后者在消化道內進行繁殖，人和動物免疫力下降或腸道受損時，其可侵入腸黏膜而致病。雖然硝基咪唑類藥物具有很好的作用效果，但禁用于食品動物，病人使用時也會出現惡心、嘔吐等消化道反應和頭痛、眩暈等神經系統癥狀，非人靈長類動物也因其食口性差而拒食，且存在毒副作用的不確定性，用藥后風險性較大。本試驗參考有關水生動物急性毒性試驗方法的基本原理，從 30 種中草藥中初步篩選出 16 種對結腸小袋纖毛蟲有效的品種，為體內消滅該蟲體提供了理論依據。

中草藥煎液成分復雜，今后要用多種溶劑提取其不同有效成分，進一步研究其作用成分和作用機制。同時，還要利用動物試驗對初步篩選出的中草藥品種進一步研究，找出恰當的劑量及劑型，以便進行臨床試驗及推廣。

參考文獻：

[1] 蔣金書.動物原蟲病學[M].北京：中國農業大學出社，2000.329-333.

[2] 丁 濤，徐錦忠，沈崇鈺，等.高效液相色譜-串聯質譜聯用測定蜂蜜中3種硝基咪唑類殘留[J].分析化學，2006，34（8）：1206.

[3] 閆文朝，王天奇，丁 軻，等.DMEM培養結腸小袋蟲的正交試驗[J].動物醫學進展，2010，31（8）：34-37.

[4] 胡元亮.獸醫中藥學[M].北京：中國農業出版社，2007.164.

[5] 周永欣，章宗涉.水生生物毒性試驗方法[M].北京：中國農業出版社，1989.114-122.