分子標記技術及其在油茶遺傳育種中的應用

摘要：分子標記技術為植物遺傳育種研究提供了新途徑，綜述了部分分子標記技術的原理及其在油茶遺傳育種研究中的應用現狀。

關鍵詞：分子標記；油茶；應用

中圖分類號：S515 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）03-0053-03

油茶（Camellia oleifera）別名茶子樹、茶油樹、白花茶，其油茶子油是我國南方地區人民喜愛的食用油，不飽和脂肪酸為油茶子油中較穩定的油酸，不穩定的多不飽和脂肪酸含量較少，且油中富含生育酚、角鯊烯等天然抗氧化劑，因此油茶子油溫度性好，不易氧化酸敗，是一種優質食用油[1]。曾經油茶作為一種經濟林樹種得到了廣泛的栽培，但卻忽略了品種的優選工作，導致在長時間內多數油茶掛果率低、油品不高、經濟效益低下。現如今由于人們追求天然、安全、保健的飲食新時尚，茶油在糧油市場中凸顯出重要的價值，這就需要選育出優良高產的油茶品種，以適應市場的需求。

在植物遺傳育種研究中，使用較多的方法是傳統育種，但傳統育種方法通常周期長，帶有一定的盲目性。現在提倡分子標記輔助育種與傳統育種相結合，分子標記輔助育種是利用分子標記技術，借助于目標基因緊密連鎖的遺傳標記的基因型分析鑒定含有目標基因的個體，從而提高選擇效率，減少盲目性，加速育種進程，在一定程度上彌補了傳統育種缺陷。與形態學和同工酶標記相比，分子標記技術具有明顯的優越性，分子標記技術已是植物遺傳改良研究中強有力的工具。它不受個體發育時期和環境條件的影響，直接反映了DNA水平上的遺傳變異情況，可以穩定遺傳。大多數分子標記呈共顯性遺傳，有利于隱性性狀的選擇，而且基因組變異豐富，分子標記的數目幾乎是無限的。

現今，已有多種分子標記技術應用于油茶遺傳多樣性、品種鑒定等方面的研究。本文就已使用的分子標記的原理和在育種上的應用情況進行綜述，以期對油茶資源的利用和開發提供有益的參考。

1 分子標記技術簡介

1.1 AFLP技術

擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技術由荷蘭科學家Zabeau與Vos等[2]創建的，是RFLP技術和PCR技術的結合，具有前者的可靠性和后者的高效性。

AFLP技術先用兩種限制性內切酶切割基因組DNA，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，形成一個帶接頭序列的特異片段，作為引物結合位點。通過接頭序列和PCR引物3′末端的選擇性堿基的識別，擴增那些兩端序列能與選擇性堿基配對的限制性酶切片段。由于引物的合成具有特異性，從而使擴增產物也具有特異性[3，4]。

1.2 RAPD技術

隨機擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA， RAPD）技術是1990年美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh領導的2個小組幾乎在同時發展起來的[5，6]。它是以一種或多種人工合成的、長約9～10個寡核苷酸的隨機引物對靶基因組DNA進行PCR擴增，再進行電泳分離和對DNA片段染色，由于引物對不同物種的基因組DNA擴增區域片段長度的差異產生多態性[7，8]。1.3 ISSR技術

簡單重復間序列標記（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利爾大學Zietkiewicz等于1994年創建的一種分子標記技術[9]，利用SSR在基因組DNA中廣泛存在的特性，在3′或5′端錨定2～4個堿基做引物，對兩端具有反向排列SSR間的一段序列進行PCR擴增。ISSR分子標記不僅具備SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標記的優點，并且與SSR相比其多態性更為豐富[10，11]。

1.4 SRAP技術

相關序列擴增多態（Sequence-related amplified polymorphism，SRAP）標記是由美國加州大學作物系Li于2001年在研究蕓薹作物時開發出來的一種標記技術[12]，SRAP主要對植物基因組中開放閱讀框區域進行擴增，利用外顯子富含GC而啟動子、內含子富含AT的特點設計引物。其上游引物主要結合在外顯子區域，對外顯子進行特異擴增，下游引物的結合位點在內含子區域或啟動子區域，對內含子區域、啟動子區域進行特異擴增。由于在物種間或同一物種的不同個體間內含子、啟動子與間隔序列長度是不等的，從而造成多態性的產生[13]。

2 分子標記技術在油茶遺傳育種中的應用

2.1 遺傳多樣性研究

遺傳多樣性在一定程度上能反應植物對環境的適應能力，其研究結果為植物種質資源保護、品種改良和開發利用提供理論基礎。油茶屬異花授粉植物，由于長期的自然選擇和人工選擇，可能其種內變異比較豐富，遺傳背景也比較復雜。楊揚等[14]利用9對多態性較為理想的SRAP標記對6個小果油茶群體的180份材料進行遺傳多樣性研究，共擴增出184條帶，全部為多態性條帶，多態性位點比率高達100%，有效等位基因數（Ne）為1.776 3，Nei基因多樣性指數（H）為0.432 8，平均Shannon（I）信息指數為0.623 3，說明小果油茶群體具有較為豐富的遺傳多樣性，但其遺傳變異主要分布在群體內，群體間變異相對較小?；谘芯拷Y果，提出了一些對該物種遺傳多樣性的保護策略。張婷等[15]采用AFLP標記對來自湖北省5個地區的油茶遺傳多樣性進行研究。在4對引物對48個個體擴增中，共獲得清晰的擴增條帶45條，其中多態性條帶38條，多態性位點比例為84.44%，油茶居群的多態位點在22.22%～53.33%，有效等位基因數（Ne）在1.140 1～1.228 3，Nei基因多樣性指數在0.084 3～0.144 2，Shannon 信息指數在0.126 2～0.227 8。說明油茶不同居群間遺傳多樣性水平相差較大，油茶遺傳分化主要存在于居群內。范小寧等[16]為了深入掌握油茶雜交子代的遺傳多樣性程度，為油茶雜交育種選育提供指導和理論支撐。用9對條帶豐富、多態性高、重復性好的引物組合，采用優化的SRAP-PCR反應體系對4個控制授粉家系的子代合計共52個個體進行PCR擴增，結果共檢測到191個位點，平均每對引物21.2個，擴增片段長度在100～700 bp，其中多態性位點191個，多態位點百分比高達100%，Nei基因多樣性指數（H）為0.333 7～0.366 4，Shannon信息指數（I）為0.503 8～0.545 0。結果表明遺傳多樣性主要存在于家系內，而家系間的遺傳多樣性較小，僅只占總遺傳變異的4.78%。4個控制授粉家系內各個子代個體間都存在著豐富的遺傳多樣性。結果提示在通過雜交育種技術培育油茶新品種工作中，應以雜交后代個體選擇為主，而優良家系選擇對油茶產量提升的潛力較小。

2.2 品種鑒定

在傳統育種工作的基礎上，大部分植物都培育了很多品種，一些品種具有較為相似的形態，并且也存在同物不同名的現象。目前在油茶良種的鑒別中主要還是使用形態標記，包括葉片、枝條或者種子的形態，當這些形態學標記一旦脫離油茶植株個體后，良種無性系或種源在形態上高度相似，時常出現假冒良種的情況，對油茶產業造成較大的損失，嚴重地影響了我國油茶良種化的進程，不利于油茶產業迅速發展。鑒于此，為了有效地區分油茶品種就必須建立合適的分子鑒別機制。韓欣等[17]以14個贛南油茶良種為研究對象，提取葉片基因組DNA作為擴增模板，篩選出穩定性高的引物組合，采用優化的SRAP-PCR反應體系，對獲得的清晰且重復性強的條帶進行{0，1}數據轉換，并根據SRAP譜帶特征建立了贛南油茶良種的分子鑒別體系，為油茶良種的分子鑒定提供了理論依據和技術基礎。油茶良種鑒別是解決目前生產上種苗混亂的重要途徑，林萍等[18]采用SRAP方法，對油茶長林系列12個優良無性系進行分析。利用篩選出的15對多態性高引物，共擴增得到423個位點，多態性位點比例為93.14%，品種特異性位點達50個，其中有13對引物能夠獨立鑒別所有供試材料。為了提高鑒別效率，選擇24個多態性高的位點進行組合，建立了所有供試材料的DNA指紋圖譜，實現了供試材料的有效鑒別。

2.3 親緣關系分析

親緣關系是育種時雜交親本選擇的基礎，弄清不同品系間的遺傳相似性，減少雜交親本選擇的盲目性。彭方仁等[19]利用ISSR和SRAP兩種分子標記對192 份油茶種質材料進行分析，其中有171份來自湖南長沙的瀏陽油茶豐產栽培示范基地（湖南省油茶良種示范基地的煙坡、北坡、馬家塘和溫室大棚），另外21份采自南京林業大學樹木園（該樣品材料為移栽的1年生油茶嫁接苗）。結果表明油茶種質資源的遺傳相似系數范圍分別為0.52～1.00和0.65～0.95，說明這些油茶種質材料間的遺傳相似度較高，親緣關系比較接近，也說明了所收集的油茶種質材料的遺傳基礎比較狹窄。于小玉等[20]以湖南、湖北兩省主要油茶品種為試驗材料，利用ISSR 分子標記技術對66個油茶品種的親緣關系進行了探討。這66個油茶品種在相似系數0.61水平處分為3大類，從聚類分析結果看，部分地理來源相同或遺傳背景相似的品種資源能夠聚在同一類群，但也有一些地理來源及遺傳背景不一致的品種資源也聚集在同一類群，顯示的親緣關系較為復雜，導致聚類結果的不規律。分析其原因可能是油茶已有悠久的栽培歷史，在長期的栽培歷史中，各油茶產區遺傳資源不斷交流所致，也有可能是研究的品種數量不均勻所致。

油茶與油棕、橄欖和椰子并稱為世界四大木本油料樹種，在我國已有2 000多年的利用和栽培歷史，但其發展狀態一直起伏不定。自20世紀70年代開展油茶優樹選育以來，全國已選出了200多個油茶優良無性系、優良家系等良種，在生產中應用已顯示出了巨大的增產潛力，但距離實現油茶生產良種化還很遠[21]。這就需要加快良種的選育進度，加快分子標記輔助育種與傳統育種的結合。雖然應用分子標記技術對油茶的研究已取得一定的成績，但與其它植物或農作物相比，油茶的分子標記研究遠遠落后，在遺傳圖譜構建、基因定位等方面尚無報道。在今后，要利用分子標記技術，積極開展油茶基因組學研究，培育并篩選出更高產量、高含油量、高抗逆性的油茶新品種。

參考文獻：

[1] 羅曉嵐，朱文鑫.油茶籽油加工和油茶資源綜合利用[J].中國油脂，2010，35（9）：13-17.

[2] VOS P， HOGERS R， BLEEKERR M， et al. A new technique for DNA finger printing[J]. Nucleic Acids Research，1995， （23）： 4407-4414.

[3] 肖 碩.AFLP分子標記技術在中藥研究中的應用進展[J].生物技術通報，2010，（12）：69-72.

[4] 姚紅偉，袁 霞，付 鑫，等.AFLP分子標記技術及其在水產動物中的應用[J].現代信息，2009，24（7）：22-24.

[5] WILLIAMS J G ， KUBELIK A R， LIVAK K J， et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Res，1990，18（22）：6531-6535.

[6] WELSH J， MCCLELLADD M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers [J]. Nuc leic Acids Res， 1990， 18（24）： 7213-7218.

[7] 邢秀芹.RAPD技術的應用[J].食品科技，2010，35（12）：314-316.

[8] 孟子燁，陳曉琴，江世宏，等.RAPD技術在昆蟲分類研究中的應用[J].重慶師范大學學報（自然科學版），2009，26（2）：33-38.

[9] ZIETKIEWICZ E，RAHH A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994，20（2）：176-183.

[10] 朱巖芳，祝水金，李永平，等.ISSR分子標記技術在植物種質資源研究中的應用[J].種子，2010，29（2）：55-59.

[11] 雒新艷，戴思蘭ISSR分子標記在觀賞植物研究中的應用[J].湖北農業科學，2009，48（7）：1761-1768.

[12] LI G， QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP）， A new marker system based on a simple PCR reaction： its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet， 2001，103：455-461.

[13] 張 婷，劉雙青，呂明治.相關序列擴增多態（SRAP）在農作物遺傳育種中的應用[J].現代農業科技，2010，（11）：79-80，82.

[14] 楊 揚，洪亞輝，黃 勇，等.西南地區小果油茶群體遺傳多樣性的SRAP分析[J].湖南農業科學，2011（13）：1-4.

[15] 張 婷，劉雙青，梅 輝，等. 湖北省不同地區油茶遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 安徽農業科學，2011，39（23）：14070-14071，14075.

[16] 范小寧，林 萍，張盛周.油茶控制授粉子代遺傳多樣性的SRAP分析[J].華北農學報，2011，26（s）：11-17.

[17] 韓 欣，張黨權，王志平，等.基于SRAP的贛南油茶良種分子鑒別研究[J].中南林業科技大學學報，2012，32（3）：147-151.

[18] 林 萍，姚小華，王開良等.油茶長林系列優良無性系的SRAP分子鑒別及遺傳分析[J].農業生物技術學報，2010，18（2）：272-279.

[19] 彭方仁，吳鶯鶯，郝明灼，等.利用ISSR和SRAP標記分析油茶遺傳多樣性[J].南京林業大學學報（自然科學版），2012，36（5）：19-25.

[20] 于小玉，喻方圓，劉建兵，等.ISSR在油茶品種鑒別和遺傳多樣性分析中的應用[J].南京林業大學學報（自然科學版），2013，37（1）：61-66.

[21] 劉躍進，歐日明，陳永忠.我國油茶產業發展現狀與對策[J].林業科技開發，2007，21（4）：2-4.