仔豬大腸桿菌和C型產氣莢膜梭菌的毒力研究

摘要：為了確定不同纖毛抗原的豬大腸桿菌和C型產氣莢膜梭菌引起試驗動物發病的最小菌（毒）含量，用不同菌數的E.coli C83549（K88）、C83644（K99）和C83710（987P）菌株培養物對出生18～24 h的仔豬進行攻毒，用不同毒素含量的C型產氣莢膜梭菌毒素分別對出生18～24 h的仔豬和家兔進行攻毒。結果表明，引起仔豬發病的大腸桿菌三種菌株的最低含量均為150×108 CFU，C型產氣莢膜梭菌引起1日齡仔豬和家兔發病的最低毒素含量分別75和80小鼠MLD。

關鍵詞：大腸桿菌；C型產氣莢膜梭菌；毒力試驗

中圖分類號：S852.7 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）03-0029-03

仔豬紅痢和黃痢是新生仔豬最常見的兩種傳染病，主要發生于出生后1周內的新生仔豬，發病急、死亡快，常常給養豬業造成非常巨大的經濟損失[1]。

仔豬黃痢主要是由致病性大腸桿菌（EPEC）引起發病， EPEC不侵入上皮細胞，而是利用一種或多種菌毛粘附因子，如F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）或F41和F42吸附在新生仔豬小腸黏膜上繁殖并產生腸毒素。該病常發生于出生后1周以內的仔豬，以1～3日齡最常見，7日齡以上很少發生，同窩仔豬發病率可達到90%以上，死亡率極高，甚至全窩死亡，給養豬生產帶來極大的危害。仔豬紅痢是由C型產氣莢膜梭菌引起的，該菌為革蘭氏陽性有莢膜不運動的厭氧大桿菌，可產生致死毒素，引起仔豬的腸毒血癥，壞死性腸炎。該病主要侵害出生后3 d以內仔豬，病程短促，有些在生后3 d內全窩死亡，最急的臨床癥狀多不明顯，一發現癥狀即迅速死亡，發病率可達40%～50%，病死率可高達100%[2]。

國內外對于仔豬紅痢和黃痢的主要預防措施是進行免疫接種。目前用于預防這兩種疾病的疫苗有仔豬紅痢氫氧化鋁膠滅活疫苗及大腸桿菌病油乳劑滅活疫苗和基因工程苗，這些疫苗均為單聯疫苗或多價苗，在實際應用過程中受到很大限制，鑒于此，本研究室開展了新生仔豬大腸桿菌病和C型產氣莢膜梭菌病二聯滅活疫苗的研究。在二聯疫苗效力試驗中，為了準確掌握動物的攻毒劑量，保證疫苗的免疫效果，開展了仔豬大腸桿菌和C型產氣莢膜梭菌對仔豬的毒力以及C型產氣莢膜梭菌對家兔的毒力研究，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 菌種

大腸桿菌制造和檢驗用菌種為大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）菌株；C型產氣莢膜梭菌制造和檢驗用菌種為C59-2菌株，均由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應。

1.2 試驗動物

1.2.1 初生仔豬 經間接血凝試驗檢測其血清大腸桿菌K88、K99、987P纖毛抗體效價均不高于1∶8，經血清中和試驗檢測C型產氣莢膜梭菌毒素抗體陰性的未免疫健康初胎懷孕母豬所產18～24 h仔豬，由武漢金鷹牧業有限公司提供。

1.2.2 家兔 1.5～2.0 kg健康家兔購自武漢市萬千佳禾實驗動物養殖場。

1.3 大腸桿菌攻毒菌液的制備

按3%～5%的接種劑量將大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）菌株接種Minca湯培養基，在36～37 ℃條件下培養7 h，收獲菌液，細菌計數。調整細菌濃度為100×108 CFU/mL。

1.4 C型產氣莢膜梭菌攻毒毒素的制備

將C型產氣莢膜梭菌C59-2菌株按1%～2%接種厭氣肉肝湯，培養16～18 h，收集菌液，離心，取上清，測定毒素液對小白鼠最小致死量（MLD）。調整毒素含量為100 MLD/mL。

1.5 大腸桿菌對仔豬的毒力測定

分別用100×108 CFU、150×108 CFU、200×108 CFU、250×108 CFU的大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）口服攻毒出生18～24 h的仔豬5頭，根據每組仔豬發病（腹瀉和死亡）情況，確定各血清型大腸桿菌引起仔豬發病的最小的菌數含量。

1.6 C型產氣莢膜梭菌毒素的毒力試驗

1.6.1 C型產氣莢膜梭菌對家兔毒力試驗 分別用60 MLD、65 MLD、70 MLD、75 MLD、80 MLD和85 MLD 靜脈注射1.5～2.0 kg家兔5只，觀察24 h家兔的死亡情況，確定毒素對家兔的最小發病劑量。

1.6.2 C型產氣莢膜梭菌對仔豬毒力試驗 分別用60 MLD、65 MLD、70 MLD、75 MLD、80 MLD和85 MLD 靜脈注射 18～24 h仔豬5頭，觀察24 h仔豬的死亡情況，確定引起仔豬死亡的最小梭菌毒素含量。

2 結果與分析

2.1 大腸桿菌對仔豬的毒力測定結果

用不同菌數的大腸桿菌C83549（K88）、C83644（K99）、C83710（987P）培養物分別口服攻毒出生18～24 h仔豬，結果（表1）顯示每頭仔豬經口灌服150×108CFU大腸桿菌，可引起仔豬100%發病，確定150×108CFU為大腸桿菌引起仔豬發病的最小劑量。

2.2 C型產氣莢膜梭菌毒素的毒力試驗結果

2.2.1 C型產氣莢膜梭菌對家兔毒力試驗結果 用不同劑量（小鼠MLD）的C型產氣莢膜梭菌毒素靜脈注射體重為1.5～2.0 kg健康家兔，每只注射80倍MLD可引起家兔100%死亡，確定C型產氣莢膜梭菌引起家兔發病死亡的最小毒素含量為80倍MLD（表2）。

2.2.2 C型產氣莢膜梭菌對仔豬毒力試驗結果 用不同劑量（MLD）的C型產氣莢膜梭菌毒素靜脈注射出生18～24 h內的新生仔豬，每頭注射75倍MLD可引起仔豬100%死亡，確定C型產氣莢膜梭菌引起仔豬發病死亡的最小毒素含量為75倍MLD。

3 小結與討論

（1）新生仔豬紅痢（大腸桿菌病）和黃痢（產氣莢膜梭菌病）是新生仔豬最常見的兩種腸道傳染病，主要引起出生后1周內的新生仔豬腹瀉，由于發病急、死亡快，給養豬業造成很大的經濟損失。因此為了防止該病的發生，最好的辦法是制備疫苗對母豬進行免疫接種，初生仔豬通過吸吮母乳來獲得被動免疫[3]。我們用含K88、K99、987P纖毛抗原的大腸桿菌和C型產氣莢膜梭菌分別接種于適宜培養基培養、制備了仔豬大腸桿菌病、C型產氣莢膜梭菌病二聯滅活疫苗，為了檢驗疫苗的效果，需要對動物進行免疫攻毒試驗，掌握好攻毒的劑量是影響疫苗效力的關鍵，因此，本研究對豬大腸桿菌和C型產氣莢膜梭菌的毒力開展了研究，由于疫苗的效力檢驗中涉及用家兔替代本動物做效力檢驗，因此也進行了C型產氣莢膜梭菌毒素對家兔的毒力試驗。

（2）大腸桿菌不同纖毛抗原菌株對18～24 h初生仔豬具有較強的致病性，其致病性的強弱與感染菌數有很大關系，研究結果表明，150×108 CFU的大腸桿菌K88、K99、987P菌株均可引起仔豬100%發病。C型產氣莢膜梭菌可引發仔豬紅痢，該型菌的主要致病毒素是α和β外毒素，對仔豬具有非常強的致死性，在C型產氣莢膜梭菌感染治病的過程中，外毒素起著非常關鍵的作用[4]，研究表明，C型產氣莢膜梭菌毒素引起初生仔豬100%死亡的劑量是75個小鼠MLD，80個小鼠MLD可引起家兔100%死亡。

參考文獻：

[1] 張紅英，楊 霞，盧中華.魏氏梭菌腸毒素研究進展[J].中國畜牧獸醫，2004，31（9）：35-37

[2] 劉澤文，熊忠良，楊克禮，等.新生仔豬紅黃痢二聯滅活疫苗的研制與應用Ⅰ—C型魏氏梭菌生物學特性研究[J].安徽農業科學，2008，36（21）：9063-9064.

[3] 韓學波，曾 瑾，王玉炯，等. C 型產氣莢膜梭菌保護性抗原的免疫原性[J].中國生物制品學雜志，2008，21（3）：201-203.

[4] 斯特勞 B E. 豬病學[M].趙德明，張中秋，沈建忠，譯.北京：中國農業出版社，2000.