沉默AFP基因可抑制肝癌HepG2細胞Survivin mRNA的表達*

方 念 方紫凌 張慧卿 韓小妮 黃 根 王農榮 熊建萍 張焜和

甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），作為血清標記物已廣泛應用于肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的臨床診斷、治療及預后判斷［1］。近年研究表明，AFP在HCC的細胞增殖和凋亡中發揮重要作用［2-3］。Survivin是近年發現的凋亡蛋白抑制因子家族成員，其最顯著的特點是僅在各種腫瘤中表達，而在正常分化組織中沉默，是當今研究的熱點之一［4］。研究表明，肝癌組織中Survivin呈高表達狀態，是獨立的預后不良因素［5］。目前，肝癌細胞AFP與Survivin之間調控關系的研究，國內外鮮有報道。本研究以肝癌細胞HepG2為研究對象，通過RNA干擾技術沉默AFP，檢測細胞凋亡和Survivin基因表達的變化，以探討肝癌AFP基因靶向RNA干擾治療的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養基購自美國GibcoBR公司；胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供；Lipofectami-neTM2000轉染試劑購自美國綠陽公司；AFP定量測定試劑盒（ELISA）由鄭州安圖綠科生物工程有限公司提供；AFP基因的RNA干擾系列和相關引物由上海生工生物工程公司設計與合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 肝癌細胞株HepG2細胞由南昌大學消化研究所惠贈，將細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，接種于37℃，5%CO2，飽和濕度的孵箱中培養。

1.2.2 實驗分組 本研究實驗細胞共分為3組，即實驗組、脂質體+空質粒對照組和空白組。

1.2.3 ELISA法測定HepG2細胞上清液AFP 接種培養HepG2細胞，分別收集轉染前和轉染后12、24、48 h的細胞培養上清液，3 000 rpm，4℃離心10 min，取上清液。按照試劑盒說明書操作，采用ELISA法檢測AFP含量。

1.2.4 siRNA沉默HepG2細胞AFP基因 1）本研究選取的AFP siRNA目的基因片段：5'-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3'，送上海生工設計、合成干擾系列和引物。上游引物系列：5'-AAA TAC ATC CAG GAG AGC CA-3'，下游引物系列：5'-CTG AGC TTG GCA CAG ATC CT-3。2）構建載體：參照亓同鋼等［6］報道的方法構建AFP基因siRNA表達質粒。3）質粒轉染：取對數生長期的HepG2細胞，經0.25%胰蛋白酶消化，用不含血清、抗生素的RPMI 1640培養基將細胞重懸。每組設立3個復孔，加質粒和經稀釋的LipofectamineTM2000轉染復合物，室溫孵育4 h，于12 h和24 h更換培養基，48h收獲細胞。

1.2.5 細胞增殖與凋亡的檢測 1）MTT法檢測HepG2細胞增殖：收集轉染前和轉染后12、24、36、48 h的HepG2細胞，每組設9個復孔，每孔終體積為200 μL，每孔內加入20 μL MTT溶液（3 g/L），將細胞移入培養箱繼續培養6h。吸去培養基，每孔內加入150 μL DMSO，振蕩搖勻，用酶標儀于490 nm波長條件下測定吸光度值。2）AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細胞儀檢測HepG2細胞凋亡：收集轉染前和轉染后12、24、48 h HepG2細胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集總細胞，PBS洗滌2次，棄上清。加入400 μL結合緩沖液使細胞重懸，再加6 μL Annexin V-FITC，4 μL PI，室溫避光孵育15 min。采用激發波長488 nm，分別以紅色和綠色熒光通道檢測細胞凋亡。

1.2.6 逆轉錄-PCR檢測Survivin基因 采用RT-PCR半定量檢測各組轉染前后Survivin基因的表達，收集各組轉染前和轉染后12、24、48 h的HepG2細胞，以合成的Survivin基因特異性引物進行擴增。上游引物系列：5'-CCG CAT ACA GTG GTC GAG AGA-3'，下游引物系列：5'-GTG TAG GGT GTA GAA TCC TGT TCA-3'。

2 結果

2.1 轉染前后各組細胞上清液AFP水平

采用ELISA法檢測HepG2細胞上清液AFP濃度，所得結果（表1）。

表1 轉染前后肝癌細胞培養上清液中AFP的濃度（ng/mL）Table1 AFP level in the supernatant of hepatocellular carcinoma HepG2 cells

2.2 AFP siRNA轉染后HepG2細胞生長活力下降

收集經轉染后12、24、36、48 h的HepG2細胞，采用MTT法檢測細胞活性（圖1），結果發現轉染24 h和48 h后轉染組與對照組間有顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 MTT檢測AFP siRNA轉染后HepG2細胞增殖Figure1 Effects of AFP siRNA on HepG2 cell proliferation detected by MTT assay

2.3 AFP siRNA轉染后HepG2細胞凋亡增加

本研究檢測了轉染AFP-siRNA 48 h后，各組HepG2細胞的凋亡率。結果發現轉染組AFP-siRNA的細胞凋亡率為35.6%，較轉染前增加了24.3%。陰性對照組和空白組細胞凋亡率分別為12.5%和11.3%，實驗組細胞凋亡率較陽性對照組和陰性對照組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05，圖2）。

2.4 HepG2細胞AFP siRNA對Surivivin基因表達的影響

收集12、24和48 h后轉染組與對照組細胞，經基因擴增，UV凝膠圖像分析儀分析電泳結果，AFP-siRNA轉染24、48 h后Survivin mRNA較轉染前減少59%、78%。HepG2細胞上清液AFP水平與HepG2細胞Survivin-mRNA表達的變化具有較強的一致性（圖3）。

圖2 轉染AFP-siRNA-48 h后HepG2細胞凋亡率Figure2 Effects of AFP siRNA on HepG2 cell apoptosis

圖3 AFP-siRNA轉染后AFP和Survivin mRNA表達的變化Figure3 Changes in AFP and Survivin mRNA expression after AFP-siRNA silence

3 討論

由于大量慢性乙型肝炎感染人群的存在，原發性肝癌仍是我國高發的重大疾病［7］。近年來，肝癌的治療效果有所提高，其主要原因之一是以AFP為基礎的血清學檢測技術以及結合現代影像技術的進步，提高了肝癌的早期診斷率，進而提高了肝癌患者的早期處理比例［8］。AFP廣泛應用于HCC的診斷、監測和隨訪，但其生物學功能直到近來才引起人們注意。大量研究證實，AFP具有復雜的生物學功能，如促進肝癌細胞增殖、抑制凋亡和免疫逃避［2，9］。

本研究通過小RNA干擾技術沉默肝癌HepG2細胞中AFP基因的表達，結果顯示，在轉染48 h后，肝癌細胞培養上清液中AFP的濃度明顯下降［由（988.45±12.58）ng/mL降至（154.23±7.78）ng/mL］，與對照組相比有顯著差異，提示轉染成功。轉染48 h后，實驗組肝癌細胞生長被抑制43.04%，而細胞凋亡率則增加24.3%，即沉默肝癌細胞AFP基因的表達后，細胞增殖降低，細胞凋亡增加，這與Yang等［3］報道的結果相似。

Survivin是一種凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP），在除甲狀腺、胸腺及生殖腺以外的分化成熟的成人組織中表達缺失，而在絕大多數腫瘤組織中表達陽性，這種表達特性使其迅速成為惡性腫瘤診斷與治療研究的新靶點。研究表明，Survivin在肝癌細胞高表達，調控著細胞的分裂、增殖和凋亡［10-11］。

如前所述，我們通過RNA干擾下調肝癌HepG2細胞AFP基因表達之后，肝癌細胞的凋亡率增加。本研究還觀察到在轉染的過程中，隨著培養上清液AFP濃度的持續下降，Survivin mRNA的水平也逐漸降低，兩者表現出較好的一致性。因此，我們推測細胞凋亡率的變化可能與Survivin的表達下降相關，即沉默AFP基因能抑制Survivin表達，進而促進凋亡。與我們的報道相符，Li等［12］在Bel7402細胞的研究中發現，通過AFP抗體抑制AFP的表達后Survivin水平明顯降低，肝癌細胞凋亡效果加強，同時認為AFP通過上調Survivin的表達來抑制TRAIL誘導凋亡的活性。

AFP在肝細胞癌的發生、發展中發揮重要作用，通過本研究表明，通過RNA干擾技術阻斷AFP表達，對于控制AFP陽性HCC的發展及術后復發可能具有重要價值。

1 Debruyne EN,Delanghe JR.Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein:new aspects and applications[J].Clin Chim Acta,2008,395(1-2):19-26.

2 Li M,Li H,Li C,et al.Alpha fetoprotein is a novel protein-binding partner for caspase-3 and blocks the apoptotic signaling pathway in human hepatoma cells[J].Int J Cancer,2009,124(12):2845-2854.

3 Yang X,Zhang Y,Zhang L,et al.Silencing alpha-fetoprotein expression induces growth arrest and apoptosis in human hepatocellular cancer cell[J].Cancer Lett,2008,271(2):281-293.

4 Chau GY,Lee AF,Tsay SH,et al.Clinicopathological significance of survivin expression in patients with hepatocellular carcinoma[J].Histopathology,2007,51(2):204-218.

5 Yang Y,Zhu J,Gou H,Clinical significance of Cox-2,Survivin and Bcl-2 expression in hepatocellular carcinoma(HCC)[J].Med Oncol,2011,28(3):796-803.

6 亓同鋼,汪運山,王 芳,等.AFP基因siRNA表達質粒的構建及鑒定[J].山東大學學報,2004,42(3):353-354.

7 鄭榮壽,張思維,吳良有,等.中國腫瘤登記地區2008年惡性腫瘤發病和死亡分析[J].中國腫瘤,2012,21(1):1-12.

8 吳孟超.原發性肝癌的診斷及治療進展[J].中國醫學科學院學報,2008,30(4):363-365.

9 Um SH,Mulhall C,Alisa A,et al.Alpha-fetoprotein impairs APC function and induces their apoptosis[J].J Immunol,2004,173(3):1772-1778.

10 Zhu H,Chen XP,Zhang WG,et al.Expression and significance of new inhibitor of apoptosis protein survivin in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(25):3855-3859.

11 Zhao X,Ogunwobi OO,Liu C.Survivin inhibition is critical for Bcl-2 inhibitor-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J].PLoS One,2011,6(8):e21980.

12 Li M,Zhou S,Liu X,et al.alpha-Fetoprotein shields hepatocellular carcinoma cells from apoptosis induced by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand[J].Cancer Lett,2007,249(2):227-234.