人間充質干細胞表面標記分子的研究進展

李秋晨 綜述 肖苒 審校

干細胞根據所處的發育階段可分為胚胎干細胞和成體干細胞，間充質干細胞（MSC）是成體干細胞家族的重要成員，是一類中胚層來源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，主要存在于全身結締組織和器官間質中。MSC因具有造血支持、免疫調控以及獲取容易等特點日益受到人們的關注。在體內或體外特定的誘導條件下，MSC可分化為多種組織細胞，因此可作為理想的種子細胞參與組織器官的修復過程。但由于不同的分離方法得到的MSC的純度不同，極大地影響了療效的穩定性[1]。因此，對MSC表面標記分子進行鑒定、分選，已成為干細胞領域的研究熱點。

1 間充質干細胞表面標記分子的分類與功能

MSC表面標記分子包括相對特異性抗原、細胞因子及受體、生長因子及受體、黏附分子和細胞外基質等。在MSC的鑒定、分選過程中，黏附分子起著至關重要的作用，是介導細胞間或細胞與細胞外基質間相互接觸和結合分子的統稱。根據黏附分子結構特點，可以分為整合素家族、選凝素家族、免疫球蛋白超家族、鈣黏蛋白家族等，此外還有一些尚未歸類的黏附分子[2]。黏附分子種類繁多，各自的功能、與干細胞的相關性等，都需要更深入的探討。

1.1 免疫球蛋白超家族

免疫球蛋白超家族由一組結構相似的蛋白質組成，這組蛋白質具有與免疫球蛋白Ig同源的V區和C區。

CD90（又稱Thy-1）與細胞的黏附、分化、細胞間相互作用有關。它是人類微血管內皮細胞活化的標記，與新生血管的形成有關[3]；也是鑒別人類MSC的重要標記之一[4]。

CD106（VCAM-1）又稱可誘導細胞黏附分子，可由IL-1、TNF等細胞因子與細胞作用后表達。它在活化內皮細胞、上皮細胞表面表達；其表達與MSC的干性維持有關[5]。

CD146（MCAM，Mel-CAM）是一種鈣離子非依賴型細胞黏附分子。因最早發現其特異表達于黑色素瘤細胞，并與原位黑色素瘤細胞轉移潛能直接相關，故而又命名為黑色素瘤黏附分子（Mel-CAM）[6]。亦有研究表明，它在人血管內皮細胞上組成性表達，是內皮細胞的標記，可以促進血管內皮細胞增殖和血管的新生。

CD166（ALCAM）又稱為白細胞活化黏附因子，主要在白細胞和胸腺上皮細胞表達。它可以參與胚胎造血系統的發育和毛細血管的形成，并在維持MSC多向分化潛能方面起著至關重要的作用[7]。

CD56（NCAM）是神經細胞黏附分子的異構體和自然殺傷淋巴細胞（NK）的標記分子。它在神經系統的生長、發育過程中起著“導航”和“停泊”作用[8]；更為重要的是，它可以調節MSC向三個胚層的分化[9]。

1.2 整合素家族

整合素是一組細胞表面跨膜受體，由α鏈和β鏈以共價鍵形成異構二聚體，在識別細胞外基質成分中起著重要作用。

CD29是β1類整合素，為多種細胞外基質蛋白的受體。它的表達與MSC的遷移有關。

CD49d也為β1類整合素，主要在肥大細胞等組織細胞以及靜息狀態下的淋巴細胞和單核細胞表面表達，它可以介導造血干細胞與骨髓的黏附，參與造血干細胞的重新分布與歸巢[10-11]。

1.3 其它家族分子

CD105又稱內皮素，是轉化生長因子β超家族的成員[15]，在內皮細胞顯著表達，它的許多功能與轉化生長因子β（TGF-β）所涉及的信號通路有關[12]。CD105在血管發生發展過程中起著重要的作用，它可以維持血管的完整性[13]。

CD271是低親和力的神經生長因子受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。在骨髓間充質干細胞（BMSC）、濾泡樹突狀細胞、黑色素瘤細胞等非神經細胞表面表達[14]。它在BMSC的分離純化中起著重要作用。有研究發現，CD105、CD271以及免疫球蛋白超家族的CD146在維持MSC良好的貼壁能力以及特有的形態方面起著重要的作用[15]。

CD73又稱為胞外-5-核苷酸酶，是糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定于細胞膜外表面的一種糖蛋白。其分布廣，功能多，不僅可參與嘌呤核苷酸的補救合成途徑，還可作為一種重要的免疫信號分子，參與跨膜信號轉導及細胞的黏附[16]。CD73在間充質干細胞表面的穩定表達是鑒別MSC重要的表面標記之一。

神經節苷脂（GD2）是一類細胞膜上的糖鞘脂類化合物，其伸展于細胞膜表面的糖基具有免疫原性，能夠誘發免疫反應。

胚胎階段特異性抗原（SSEA3和SSEA4）是與細胞表面葡萄糖糖脂相關的抗原決定簇，是P血型系統家族成員，在絕大多數人紅細胞表面表達。SSEA和GD2大都在MSC的前體細胞群中表達[17-18]。

2 與間充質干細胞分離純化相關的表面陰性標記分子

一些CD分子在MSC表面陰性表達，而在造血干細胞或外周血其它細胞表面特異性表達，因此可以利用這些分子的陽性表達去除其它干擾細胞，對MSC進行分離純化。

CD34分子屬于鈣黏蛋白家族，為鈣離子依賴型黏附分子，主要參與介導特定組織或器官的同型細胞間的黏附，其結構包括胞外區、跨膜區、胞漿區3部分[19]。CD34選擇性地表達于人類及其他哺乳動物造血干細胞表面，并隨細胞的成熟，表達逐漸減弱甚至消失。CD34是造血干細胞特異性的標記物，一直被用作篩選造血干細胞（HSC）[20]，可通過該標記分子，排除造血干細胞及其他內皮祖細胞，從而對MSC進行純化。但近來發現，ADSC可以高表達CD34，這與前期研究相矛盾。

CD45又稱白細胞共同抗原，由兩條相同肽鏈構成同源二聚體，可表達于成熟紅細胞、血小板表面。由于它在造血干細胞表面高表達，所以CD45和CD34常被用作篩選造血干細胞[21]。

CD11a為淋巴細胞功能相關抗原(LFA-1)的A鏈，幾乎存在于所有外周血白細胞中，可表達于骨髓造血細胞和基質細胞表面[22]。

CD19表達于人體外周血各個階段B細胞表面，包括未成熟B細胞、初始B細胞、記憶性 B細胞表面，可以用來標定所有正常的外周血B細胞[23]。

CD14主要在單核細胞和巨噬細胞表面表達，其它細胞系統包括紅細胞、造血干細胞以及非造血系統細胞上不表達，在正常粒細胞表面僅微弱表達[24]。

3 間充質干細胞表面標記分子的表達與分離純化

2005年，細胞治療國際組織推薦了可判定人類多能MSCs的最低標準：①能在標準培養條件下貼壁生長；②CD105、CD73和CD90表達陽性，造血干細胞的表面標記CD34、CD45、CD11a、CD19或CD79a、CD14或CD11b和HLA-DR表達陰性；③特殊培養條件下，體外能分化為成骨細胞、成脂細胞和成軟骨細胞[25]。因此，利用表面標記分子對MSC進行分離純化尤為重要。

3.1 不同組織來源MSC表面標記分子的表達與分離純化

不同組織來源的MSC有其特異性的表面抗原表達，脂肪組織來源的MSC可高表達CD34，胎盤來源的MSC可表達SSEA-3、SSEA-4[26]，骨髓來源的 MSC可高表達 CD271和組織非特異性的堿性磷酸酶（TNAP）[27-29]。亦有研究指出，骨髓來源的間充質干細胞CD106陽性表達，而脂肪來源的間充質干細胞CD106表達量極低甚至不表達[30]。因此，對于不同組織來源的MSC進行分離純化需要選擇特異的標記分子[31]。

3.2 CD73、CD105和CD271可分離純化骨髓來源的MSC

MSC表面特異性高表達CD73和CD105，這兩種分子的陽性表達提示這些細胞非造血干細胞來源。由于骨髓中大部分細胞是造血干細胞，用這兩種分子標記物對骨髓中的MSC進行分離純化，可以得到較高純度的MSC。但近來研究發現這些分子標記物可以在體內多種組織細胞中表達，例如在來源于皮膚的成纖維細胞中可以檢測到這兩種標記物[32-33]。因此，用CD73和CD105分離純化結締組織中的MSC是行不通的。此外，有報道從骨髓組織中分離得到的CD271+的BMSC克隆樣集落的形成能力明顯高于CD271-的細胞[26-27]，Giemsa染色顯示CD271+的BMSC有深染的胞核和豐富的胞漿，而CD271-的細胞的形態表型卻類似于淋巴細胞，從形態學上可以容易地區分兩種細胞[34]。因此，CD73、CD105、CD271可用來分離純化骨髓來源的MSC。

3.3 CD56可以分離向軟骨細胞方向分化的MSC

研究顯示，CD271+、SSEA-3+、CD56-的 MSC 可向成脂、成骨方向分化，但不能分化為軟骨細胞。相反，CD271+、SSEA-3+、CD56+的細胞則可以向軟骨細胞方向分化。因此，CD56是分離向軟骨細胞方向分化的MSC的表面標記之一[35]。

4 間充質干細胞表面標記分子的穩定性

MSC表面標記分子并不總是穩定地表達，MSC所處的微環境不同，它們的表面標記分子也不同。在體外培養或是將其進行誘導過程中，MSC表面標記分子會發生明顯的變化[36]。例如，CD56、CD109、CD166、CD271 可以在骨髓來源的 MSC表面表達，但是隨著MSC在體外的擴增培養，表達水平卻迅速下調[27]。相反，CD318在MSC表面并不表達，但是隨著體外培養的進行，它的表達量卻逐漸增加[37]。而在STRO-1+或CD56+的MSC表面不表達的組織特異性堿性磷酸酶（TNAP），在成骨誘導分化過程中的表達卻逐步上調[38]。

隨著免疫學研究的進展，將發現更多MSC表面特異表達的標記分子。根據實驗及臨床研究的需求，對MSC進行表型鑒定及分化能力的檢測，從而分選出純度更高的干細胞群是未來研究的熱點。鑒于MSC廣闊的應用前景，相信在不久的將來，經過分離純化的MSC在修復組織缺損等過程中將扮演重要的角色。

[1] Zannettino AC,Paton S,Itescu S,et al.Comparative assessment of the osteoconductive properties of different biomaterials in vivo seeded with human or ovine mesenchymal stem/stromal cells[J].Tissue Eng Part A,2010,16(12):3579-3587.

[2] Meirelles Lda S,Nardi NB.Methodology,biology and clinical applications of mesenchymal stem cells[J].Front Biosci,2009,14(1):4281-4298.

[3] Saalbach A,Hildebrandt G,HausteinUF,et al.TheThy-1/Thy-1 ligand interactionis involved in binding of melanoma cells to activated Thy-1 positive microvascular endothelial cells[J].Microvasc Res,2002,64(1):86-93.

[4] He J,Liu Y,Zhu T,et al.CD90 is identified as a marker for cancer stem cells in primary high-grade gliomas using tissue microarrays[J].Mol Cell Proteomics,2011,11(6):M111.

[5] Zhou S,Greenberger JS,Epperly MW,et al.Age-related intrinsic changes in human bone-marrow-derived mesenchymal stem cells and their differentiation to osteoblasts[J].Aging Cell,2008,7(3):333-343.

[6] Lehmann JM,Riethmuller G,Johnson J.MUC18,a marker of tumor progression in human melanoma,shows sequence simularity to the neural cell adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily[J].Proc NatI Aead Sci USA,1989,86(24):9891-9895.

[7] Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et al.Verfaillie,Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature,2002,418(6893):41-49.

[8] 王學銘.鈣依黏附蛋白和神經細胞黏附分子的結構與功能[J].生命的化學,1995,15(2):18-20.

[9] Bruder SP,Ricalton NS,Boynton RE,et al.Mesenchymal stem cell surface antigen SB-10 corresponds to activated leukocyte cell adhesion molecule and is involved in osteogenic differentiation[J].J Bone Miner Res,1998,13(4):655-663.

[10] Qian H,Georges Labouessse E,Nystrom A,et al.Distinct roles of integrins α6 and α4 in homing of fetal liver hematopoietic stem and progenitor cells[J].Blood,2007,110(7):2399-2407.

[11] Minguell JJ,Cinget P,Erices A.Biology and clinic utilization of mesenchymal progenitor cells[J].Braz J Med Biol Res,2000,33(7):881-887.

[12] Burrows FJ,Derbyshire EJ,Tazzari PL,et al.Up-regulation of endoglinon vascular endothelial cells in human solid tumors:implications for diagnosis and therapy[J].Clin Cancer Res,1995,1(12):1623-1634.

[13] Wong SH,Hamel L,Chevalier S,et al.Endoglin expression on human microvascular endothelial cells association with beta glycan and formation of higher order complexes with TGF-beta signalling receptors[J].Eur J Biochem,2000,267:5550-5560.

[14] 楊立泉,吳文芳,時成波,等.金黃葡萄球菌Asp227 Al基因的克隆及表達[J].生物技術,2003,13(5):5-6.

[15] Zeng GF,SX Cai,GJ Wu.Up-regulation of METCAM/MUC18 promotes motility,invasion,and tumorigenesis of human breast cancer cells[J].BMC Cancer,2011,11:113.

[16] Deaglio S,Dwyer KM,Gao W,et al.Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune supression[J].J Exp Med,2007,204(6):1257-1265.

[17] Martinez G,Hoffman T,Marino R,et al.Human bone marrow mesenchymal stem cells express neuronal ganglyoside GD2:a novel surface marker for the identification of MSCs[J].Blood,2007,109:4245-4248.

[18] Yen BL,Huang HI,Chien CC,et al.Isolation of multipotent cells from human term placenta[J].Stem Cells,2005,23(1):3-9.

[19] 任素萍,奚永志.CD34分子及其單克隆抗體應用[J].中國輸血雜志,2003,16(5):350-354.

[20] Platzbecker U,Ehninger G,Bornhauser M,et al.Allogeneic transplantation of CD34+selected hematopoietic cells clinical problems and current challenges[J].Leuk Lymphoma,2004,45(3):447-453.

[21] Earl LA,Baum LG.CD45 glycosylation controls T-cell life and death[J].Immunol Cell Biol,2008,86(7):608-615.

[22] Hu DL,Cui JC,Omoe K,et al.A mutant of staphylococcal enterotoxin C devoid of bacterial superantigenic activity elicits a Th2 immune response for protection against Staphylococcus aureus infection[J].Infect Immun,2005,73(1):174-180.

[23] Perez-Andres M,Paiva B,Nieto WG,et a1.Human peripheral blood B cell compartments:a crossroad in B-cell traffic[J].Cytometry B Clin Cytom,2010,78(Suppl 1):47-60.

[24] Mason D,Simmons D,Buckley C,et al.Leukocyte Typiing[M].New York:Oxford University Press Inc,2002:761-763.

[25] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[26] Battula VL,Treml S,Abele H,et al.Prospective isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human placenta using a frizzled-9-specific monoclonal antibody[J].Differentiation,2008,76(4):326-336.

[27] Battula VL,Treml S,Bareiss PM,et al.Isolation of functionally distinct mesenchymal stem cell subsets using antibodies against CD56,CD271,and mesenchymal stem cell antigen-1[J].Haematologica,2009;94:173-84.

[28] Sobiesiak M,Sivasubramaniyan K,Hermann C,et al.The mesenchymal stem cell antigen MSCA-1 is identical to tissue non-specific alkaline phosphatase[J].Stem Cells Dev,2010,19(5):669-677.

[29] Bühring HJ,Treml S,Cerabona F,et al.Phenotypic characterization of distinct human bone marrow-derived MSC subsets[J].Ann N Y Acad Sci,2009,1176:124-134.

[30] Gronthos S,Fitter S,Diamond P,et al.A novel monoclonal antibody(STRO-3)identifies an isoform of tissue nonspecific alkaline phosphatase expressed by multipotent bone marrow stromal stem cells[J].Stem Cells Dev,2007,16(6):953-963.

[31] Bernardo ME,Emons JA,Karperien M,et al.Human mesenchymal stem cells derived from bone marrow display a better chondrogenic differentiation compared with other sources[J].Connect Tissue Res,2007,48(3):132-140.

[32] Wagner W,Wein F,Seckinger A,et al.Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow,adipose tissue,and umbilical cord blood[J].Exp Hematol,2005,33(11):1402-1416.

[33] Ishii M,Koike C,Igarashi A,et al.Molecular markers distinguish bone marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,332(1):297-303.

[34] Bühring HJ,Battula VL,Treml S,et al.Novel markers for the prospective isolation of human MSC[J].Ann N Y Acad Sci,2007,1106:262-271.

[35] Jones EA,Kinsey SE,English A,et al.Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells[J].Arthritis Rheum,2002,46(12):3349-3360.

[36] Jones EA,English A,Henshaw K,et al.Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progeni tor cells in inflammatory and degenerative arthritis[J].Arthritis Rheum,2004,50(3):817-827.

[37] Gronthos S,Zannettino AC,Graves SE,et al.Differential cell surface expression of the STRO-1 and alkaline phosphatase antigens on discrete developmental stages in primary cultures of human bone cells[J].J Bone Miner Res,1999,14(1):47-56.

[38] Vogel W,Grunebach F,Messam CA,et al.Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells[J].Haematologica,2003,88(2):126-133.