代謝組學在肝功能衰竭中的應用及研究進展

李莎莎，余祖江，闞全程

本文文獻檢索策略：

計算機檢索萬方數據庫、中國知網及PubMed等數據庫，以“肝功能衰竭”“代謝組學”及“l(fā)iver failure”“metabolomics”為檢索詞，參考國內相關文獻寫作層次，收集關于肝功能衰竭代謝組學方面的研究并記錄；根據診斷、病變程度及病因3個方面進行分類，分析、總結其代謝組學研究方法及特點。

我國病毒性肝炎發(fā)病率高，且每年因肝病死亡的人數達50萬以上。病毒性肝炎發(fā)展至肝功能衰竭后病死率極高，但肝功能衰竭的發(fā)病機制、診斷、治療及預防仍是目前研究的難題。肝臟是人體內最重要的解毒器官，也是物質能量的代謝中心，對各種藥物、毒物和體內的大多數代謝產物具有轉化作用。肝臟病變進展會導致體內物質代謝轉化系統(tǒng)發(fā)生相應轉變，并對其內源性小分子化合物產生相應影響[1]。代謝組學從小分子物質的角度研究肝功能衰竭的相關過程，通過對代謝物及其轉化途徑的分析可以更好地了解肝功能衰竭相關病理過程，在肝病研究中具有重要意義。此外，對肝功能衰竭的代謝組學研究有助于發(fā)現(xiàn)具有診斷價值的特異性標志物[2]，如乳酸、丙戊酸等，本文對以上內容進行了綜述。

1 代謝組學的概念、研究層次、分類及整合

代謝組學是繼基因組學、蛋白質組學、轉錄組學之后一個新興的后基因組學的研究領域，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分[3]。代謝組學通過研究生物體血漿、尿液、組織液、細胞培養(yǎng)液中的內源性代謝產物，定性、定量地反映生物體在不同時間及環(huán)境下的功能狀態(tài)；此外，生物體組織、器官也可以作為樣本進行代謝組學研究[4]。

基于不同研究目的和研究對象，F(xiàn)iehn等[5]將代謝組學分為4個研究層次：代謝物靶標分析、代謝譜分析、代謝物組及代謝指紋分析(對樣本進行快速的定性)。目前，肝功能衰竭的代謝組學研究主要于代謝指紋分析層次上開展。

代謝組學研究的技術手段主要包括核磁共振(NMR)、氣象色譜(GC)、液相色譜(LC)、質譜(MS)、毛細管電泳(CE)、紅外光譜、紫外光譜等，目前應用最廣泛的是NMR、GC-MS聯(lián)用技術及LC-MS聯(lián)用技術。由于代謝組學的研究對象是內源性小分子代謝產物(相對分子質量<1 000 Da)[6-7]，如糖、脂質、膽汁酸、肉毒堿、氨基酸等，而種類繁多的內源性小分子代謝產物在體內分布范圍較廣，因此常需通過聯(lián)合多種技術手段才能夠分析出特殊條件下的各種代謝產物[8-9]。

代謝組學具有高通量性和大規(guī)模性，相對單一的研究樣本、檢測技術和數據處理方法需要進一步整合以滿足代謝組學研究需求，因此逐漸出現(xiàn)了代謝組學的整合。目前代謝組學的整合主要包括：(1)研究樣本的整合：體液、細胞培養(yǎng)液、組織等；(2)檢測技術的整合：NMR與MS的聯(lián)合應用，GC-MS聯(lián)用技術和核磁共振氫譜(1H-NMR)等[10-11]；(3)數據處理方法的整合：對不同的多變量數據統(tǒng)計分析方法進一步整合，尤其是聯(lián)合了無監(jiān)督及有監(jiān)督的多變量數據統(tǒng)計分析方法，以探索肝病患者與健康人之間、不同的肝病患者之間的代謝途徑并發(fā)現(xiàn)潛在的代謝組學標志物[12-16]；(4)組學間的整合：代謝組學可以通過整合蛋白組學及基因組學從而更全面、更系統(tǒng)地了解生物體代謝物與蛋白、基因的關系。

2 代謝組學在肝功能衰竭中的應用及研究進展

肝功能衰竭是指短時間內出現(xiàn)的肝臟大面積壞死，肝臟合成清蛋白、解毒各種毒性物質、防御病毒細菌入侵及分泌細胞因子等功能均受到嚴重創(chuàng)傷，患者臨床表現(xiàn)為凝血功能障礙、黃疸、腹腔積液及肝性腦病等[17-19]，臨床癥狀多表現(xiàn)為極度乏力、食欲下降、腹脹、惡心、嘔吐、醫(yī)師改變等[20]。對代謝產物的分析在肝功能衰竭的早期診斷及治療中非常重要，肝功能衰竭的代謝組學研究是一個全新的視角，在肝功能衰竭的診斷、病情嚴重程度判斷、病因分析中具有重要的臨床價值。

2.1 診斷 肝臟主要通過一些小分子物質與其他器官進行聯(lián)系，代謝組學通過對這些小分子物質尤其是血液中的小分子物質進行研究，發(fā)現(xiàn)肝功能衰竭患者與普通肝病患者的不同之處，以便早期明確肝功能衰竭的診斷。

高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術(HPLC-MS)可以區(qū)分不同代謝產物的峰值，再應用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)發(fā)現(xiàn)病情惡化的代謝產物，如鵝脫氧膽堿甘氨酸、溶血磷脂酰膽堿等。Yang等[21]應用HPLC-MS對37例慢性乙型肝炎急性肝功能衰竭患者及50例健康者的血清進行代謝組學研究，并應用PLS-DA發(fā)現(xiàn)鵝脫氧膽堿甘氨酸(GCDCA)的個別原子及溶血磷脂酰膽堿(LPc)發(fā)生了改變，其認為這些代謝產物的變化對急性肝功能衰竭有一定的診斷價值，可能是急性肝功能衰竭的潛在生物標志物。

1H-NMR可根據不同代謝產物的信號峰值對其進行區(qū)分，代謝產物經過檢測、分析和鑒定后即進入數據分析階段，主成分分析(PCA)是最常用的數據分析技術[22]，而基于多變量的PCA可以對原始譜圖降維，再對所有樣本進行分析后就可以給出不同樣本的代謝差異。Yang等[23]應用1H-NMR對重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭患者的血清進行代謝組學研究，并應用PCA發(fā)現(xiàn)重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭患者血清乙酰乙酸鹽、蛋氨酸、三甲胺和葡萄糖水平較正常人明顯升高，而膽堿、乳酸和脂質水平明顯降低。其認為上述代謝產物的變化對區(qū)分正常人和重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭具有重要意義，可作為重癥乙型肝炎急性肝功能衰竭在分子水平上的診斷依據。GS-MS聯(lián)用技術可通過質譜庫對代謝產物譜峰和峰相對面積進行識別，再結合PCA、典型判別分析(CDA)及其他計算方法對其進一步計算和判別。Mao等[24]通過GS-MS聯(lián)用技術對不同的生物標志物進行識別，再應用3種不同的計算方法找出最優(yōu)的特征子集，從而獲得了93.62%的肝功能衰竭診斷正確率，并且發(fā)現(xiàn)了血漿檸檬酸鹽是一種重要的標志物。Feng等[25]應用GC-MS聯(lián)用技術對急性肝功能衰竭大鼠血清代謝產物進行研究，并聯(lián)合PCA軟件分析發(fā)現(xiàn)血清5-羥吲哚乙酸、β-羥丁酸鹽、葡萄糖和磷酸鹽水平增高，認為這些代謝產物變化對急性肝功能衰竭有一定的診斷價值。

2.2 病變嚴重程度 病變嚴重程度對于肝功能衰竭診斷、分類及預后判斷有非常重要的意義，但傳統(tǒng)的肝組織活檢對于凝血功能嚴重降低的肝功能衰竭患者來說具有非常高的危險性，因此從代謝組學的角度研究肝功能衰竭嚴重程度對臨床工作很有幫助。

NMR通過對不同樣本的輻射頻率進行掃描，進而形成共振峰及圖譜，可完整、快速地對生物體的血漿、組織液、尿液、細胞培養(yǎng)液等樣本進行檢測，與其他檢測方法相比，其優(yōu)勢在于重復性較好、對樣本的預處理相對簡單[26]。Amathieu等[14]應用500 MHz高場NMR技術分析肝硬化患者血清小分子物質，發(fā)現(xiàn)輕度肝功能衰竭的肝硬化患者血清磷酸膽堿及高密度脂蛋白水平較嚴重肝功能衰竭的肝硬化患者明顯升高，而血清乳酸、葡萄糖、丙酮酸、氨基酸及肌酐水平明顯降低。

在結合GS-MS聯(lián)用技術和PCA等的前提下，通過終末期肝病模型(Model for end-stage liver disease，MELD)分析可以明確地對代謝組學相關數據進行分類。Yu等[27]采用GC-MS聯(lián)用技術對乙型肝炎急性肝功能衰竭患者進行代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，其血清葡萄糖及氨基酸表現(xiàn)的色譜圖有明顯不同，提示MELD分析通過圖形識別而區(qū)分不同嚴重程度的肝功能衰竭。

2.3 病因 肝功能衰竭是多種病因相互影響的結果，其發(fā)病機制十分復雜，但具體機制目前尚不明確；了解其病因、發(fā)病機制對更好地診斷和治療肝功能衰竭非常必要。研究表明，引起肝功能衰竭的原因有地域差異，在我國主要是肝炎病毒引起，尤其是乙型肝炎病毒[28-29]，其次是肝毒性物質(乙醇、化學制劑)和藥物等[30-31]；在歐美國家主要是藥物，如對乙酰氨基酚等[32]。Yang等[33]分別采用α-萘基異硫氰酸鹽及CCl4制作肝功能衰竭鼠模型進行代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)兩個實驗組之間及其與對照組之間的血清膽汁酸峰值有明顯差異，而應用CDA對血清膽汁酸水平進一步區(qū)分并進行分組的準確率高達97.5%，提示血清膽汁酸水平可以為肝功能衰竭的病因分析提供重要依據。由于國內外關于肝衰竭病因的代謝組學研究較少，其相關的作用機制仍有待深入研究，隨著更多代謝組學研究方法在肝功能衰竭病因方面的應用，可以進一步從病因及發(fā)病機制方面來更好地了解肝功能衰竭這一肝臟疾病中的難題。

3 小結

代謝組學在肝功能衰竭中的應用具有很大優(yōu)勢，應用前景良好，雖然目前代謝組學相關的研究較多，但代謝組學的發(fā)展仍處于早期階段，而由于檢測樣本的個體差異，如生理因素、技術手段、數據處理、產物識別等原因，對相關代謝產物或代謝途徑尚不能進行全面的定性及定量分析。相信隨著整合代謝組學的發(fā)展及其在肝功能衰竭中的不斷應用，攻克肝功能衰竭，闡明其發(fā)病機制并進行有效診斷和治療將為時不遠。

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