基質金屬蛋白酶組織抑制劑:肺動脈高壓治療的潛在靶點

唐偉良，池菊芳，彭 放，郭航遠

肺動脈高壓 (pulmonary arterial hypertension，PAH)是嚴重威脅人類健康的致命性疾病，其特點是肺血管阻力逐漸增高，最終導致右心衰竭和死亡［1］。PAH有兩個典型的病理改變，即肺動脈內皮功能障礙和血管重構［2］。研究表明，在PAH的病理狀態下，基質金屬蛋白酶(MMPs)及其組織抑制劑 (TIMPs)的表達均出現上調，兩者之間處于一種失衡狀態［3－5］。MMPs/TIMPs失衡參與了細胞過度增殖和細胞外基質 (ECM)沉積［6］，在血管重構的發生發展過程中起到了十分重要的作用。

MMPs是一組包含了超過20種金屬蛋白酶的蛋白酶超家族，可以降解ECM的多種成分;而TIMPs是MMPs的內源性特異性抑制劑，包括 TIMP－1、TIMP－2、TIMP－3、TIMP－4 4個成員，可以通過與MMPs進行1∶1的結合而抑制MMPs的活性［7－8］。目前認為，MMPs 在血管重構的發展中扮演了重要角色，有大量研究試圖通過抑制MMPs的活性而達到減輕PAH的目的。然而，這些研究所得到的結果并不完全一致［9－11］，有些發現抑制MMPs可以改善PAH，而有些恰恰相反。顯然，抑制MMPs可能并不是改善PAH的合理途徑。為進一步探討改善PAH的有效方法，本文深入分析了PAH病變血管的病理改變，發現對于血管重構來說，TIMPs的參與同樣不可或缺，并提出:對于已經發生嚴重重構的肺血管，減弱TIMPs的表達或許可以改善血管重構和血管內皮修復功能，最終減輕甚至逆轉重癥PAH。

1 抑制TIMPs表達可能改善血管重構

ECM沉積和細胞增殖是血管重構的兩個重要病理變化，而MMPs/TIMPs的失衡參與了這些病變過程。在生理狀態下，血管壁內的MMPs和TIMPs之間保持一個動態平衡，相互維持著ECM的穩態。但是在PAH病理狀態下，這一平衡被打破。MMPs通過降解ECM為平滑肌細胞及成纖維細胞等提供遷移的空間，并且釋放出ECM中結合的大量生長因子，進一步促進細胞的遷移、增殖、生長等活動。同時，平滑肌細胞和成纖維細胞可以進一步分泌ECM而促進ECM沉積。細胞的過度生長和ECM過度沉積直接參與了血管重構的發生。因此，有大量研究試圖通過抑制MMPs的活性而達到減輕PAH的目的。部分研究也確實發現，通過TIMPs基因轉染或MMPs化學抑制劑的干預可以改善野百合堿誘導的 PAH［9－10］。然而，有些學者得到的結果卻恰恰相反，Vieillard－Baron等［11］研究發現，通過TIMPs基因轉染或多西環素的使用來抑制MMPs活性，反而加重了低氧誘導PAH小鼠的病情。上述矛盾的結果表明MMPs的干預或許并不是解決PAH的有效手段。

深入分析PAH肺血管病理改變及以往文獻，筆者發現:雖然PAH病理狀態下MMPs表達上調，但TIMPs表達同樣增加，且較MMPs的增加更為顯著;故認為抑制TIMPs表達或許更為合理。Lepetit等［4］通過離體培養PAH患者的平滑肌細胞后發現，該細胞過量表達TIMP－1而減少了 MMP－3的分泌。Junbao等［12］通過在體研究進一步證實PAH患者肺血管的TIMPs/MMPs的比值較生理狀態下增加，提示TIMPs的上調較MMPs更顯著。此外，有學者對PAH病變肺動脈研究后發現，在病變血管內活化的MMPs主要存在于新內膜、內膜下中膜和外膜部分，而在血管的中膜和其他部分，MMPs的活性卻被TIMPs等內源性抑制劑明顯抑制［3］。這表明在新內膜、內膜下中膜和外膜部分，活化的MMPs促進了平滑肌細胞、成纖維細胞的遷移和增殖，而在中膜部分，MMPs活性的減弱直接促成了ECM的沉積，導致了中膜肥厚。通過上述研究不難看出，TIMPs的過度表達對于肺血管重構的發生尤為重要。對于已經過度表達的TIMPs，繼續增加其表達、抑制MMPs活性或許無助于改善 PAH，反而會阻止ECM的降解進而促進ECM在血管壁的過度沉積，最終加重血管重構。那么，如果能減少TIMPs的表達，情況又會如何呢?

筆者認為，抑制TIMPs的表達或許可以通過減少ECM沉積和促進細胞凋亡而改善血管重構，而當前的部分研究結果也支持這一觀點。最近，Higuchi等［13］研究發現，對于TIMP－3基因敲除的小鼠長期喂養Nomeganitro－L精氨酸甲酯后，由該種藥物引起的高血壓和心肌微血管重構得到明顯改善，尤其是血管纖維化明顯減少。Junbao等［12］研究也發現，降低血管內TIMPs/MMPs的比值同樣有助于改善血管重構。此外，還有不少研究也發現抑制TIMPs表達有助于改善心血管疾病。例如，通過對TIMP－1基因敲除小鼠的研究發現，其動脈中膜基質降解較對照組明顯增多［14］，而其動脈粥樣斑塊的面積較對照組明顯減?。?5］。同時，TIMP－1的缺乏也有助于減少氣管移植后引起的氣管再狹窄［16］。上述研究所觀察到的結果都表明，TIMPs的抑制有助于釋放MMPs活性，增加MMPs對ECM的降解而改善一些由于ECM沉積所導致的疾病，包括血管、氣道的重構和纖維化。

顯然，在已經發生重構的血管中，抑制TIMPs的表達將有助于釋放MMPs的活性，增加ECM的降解并促使血管壁內ECM恢復到一個正常的水平。這可以直接改善由于ECM過度沉積所導致的中膜、外膜肥厚，進而改善血管重構現象。同時，TIMPs的減少還可能通過下列途徑誘導病變血管壁內過度增殖的細胞凋亡:(1)ECM是細胞賴以生存的微環境，血管壁內過度沉積的ECM開始降解，將破壞細胞－ECM以及細胞－細胞之間的連接，摧毀了細胞生存的正常環境，最終導致一部分細胞凋亡，即所謂的“失巢凋亡”［17］;(2)雖然ECM的降解可以釋放一部分促進細胞生長的因子，但同樣也會釋放出大量促細胞凋亡因子，進一步加速細胞凋亡［18］。此外，TIMPs本身可以通過激活一些特異的抗凋亡信號通路，例如Bcl－ X 和 IκB α，來發揮抗凋亡作用［19］，而減少TIMPs的表達就可以減弱其在抗凋亡方面的作用。因此，抑制或減弱TIMPs的表達可能會通過減少ECM沉積和促進細胞凋亡而改善血管重構，尤其是對于已發生重構的血管來說，這可能是一個更為合理的選擇。

2 抑制TIMPs表達可能改善內皮修復和血管再生

在PAH的發生和發展過程中，肺血管內皮功能障礙扮演了重要角色［20］，而改善內皮功能障礙對于治療PAH十分關鍵。內皮功能障礙是由于內皮損傷與修復的失衡所導致的［21］。因此，對于改善內皮功能障礙來說，非常重要的一點就是改善血管的內皮修復能力。

在內皮修復的過程中，MMPs降解ECM并釋放ECM和基膜中蘊含的促血管新生因子，包括血管內皮生長因子、纖維生長因子和轉化生長因子［18］。上述因子可促進內皮細胞的遷移、增殖和黏附。相反，TIMPs可能會通過抑制MMPs的活性而減弱血管內皮的上述修復功能。除了TIMPs通過抑制MMPs而影響血管內皮的自我修復功能以外，不少研究也發現TIMPs還可以通過非MMPs依賴的機制而影響內皮細胞功能。TIMP－1可以不依賴MMPs而抑制內皮細胞的遷移［22］，TIMP－2可以抑制纖維生長因子和血管內皮生長因子誘導的內皮細胞生長活動［23－24］，TIMP－3可以通過抑制競爭性結合血管內皮生長因子受體－2而抑制血管生成［25］，而TIMPs的上述作用均獨立于MMPs之外?？傊?，TIMPs似乎不利于血管內皮修復，故抑制TIMPs表達或許有利于改善內皮修復功能。

此外，抑制TIMPs表達有助于動員內皮祖細胞和骨髓間充質細胞，進而改善血管內皮的修復。內皮祖細胞和骨髓間充質細胞具有分化為內皮細胞的潛能［26］，能通過再內皮化和血管新生等途徑參與血管內皮的修復［21，27］。因此，提升外周循環中上述細胞的數量及其參與血管修復的能力，對于促進血管修復來說顯得十分重要。我們知道，內皮祖細胞和骨髓間充質干細胞主要從骨髓中分化和動員而來［28－29］，而研究表明 MMP －9 對于內皮祖細胞的動員十分關鍵［30］，而骨髓間充質干細胞的動員和釋放同樣需要MMP－2和 MMP－13的參與［29］。因而，減少TIMPs的表達將通過增強MMPs的活性，促進內皮祖細胞和骨髓間充質干細胞的動員和釋放，進而改善血管內皮的修復。

3 小結

綜上所述，TIMPs在PAH的發展過程中發揮了重要作用。當前的眾多研究均試圖通過上調TIMPs表達、抑制MMPs活性而改善PAH，但所得到的結果并不一致。雖然部分研究表明提升TIMPs的表達有助于改善PAH，但也有學者發現這樣反而使得情況變得更糟。筆者認為，作為重建MMPs/TIMPs平衡的另一條途徑，下調TIMPs的表達或許是值得嘗試的手段。減弱TIMPs的表達可能會通過促進血管重構和內皮修復而改善甚至逆轉PAH。然而，這方面的直接研究數據缺乏，故需要通過基因干預等手段展開深入研究，進一步闡明TIMPs在PAH中發揮的作用，并力爭探索一條改善PAH的新途徑。

1 Zhao YY，Malik AB.A novel insight into the mechanism of pulmonary hypertension involving caveolin－1 deficiency and endothelial nitric oxide synthase activation［J］.Trends Cardiovasc Med，2009，19(7):238－242.

2 Morrell NW，Adnot S，Archer SL，et al.Cellular and molecular basis of pulmonary arterial hypertension［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54(1 Suppl):S20－S31.

3 Frisdal E，Gest V，Vieillard －Baron A，et al.Gelatinase expression in pulmonary arteries during experimental pulmonary hypertension［J］.Eur Respir J，2001，18(5):838 －845.

4 Lepetit H，Eddahibi S，Fadel E，et al.Smooth muscle cell matrix metalloproteinases in idiopathic pulmonary arterial hypertension［J］.Eur Respir J，2005，25(5):834－842.

5 Prabha M，Jin HF，Tian Y，et al.Mechanisms responsible for pulmonary hypertension［J］.Chin Med J，2008，121(24):2604 －2609.

6 Shimoda LA，Laurie SS.Vascular remodeling in pulmonary hypertension［J］.J Mol Med(Berl)，2013，91(3):297－309.

7 Murphy G.Tissue inhibitors of metalloproteinases［J］.Genome Biol，2011，12(11):233.

8 Nagase H，Visse R，Murphy G.Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs［J］.Cardiovasc Res，2006，69(3):562－573.

9 Vieillard－Baron A，Frisdal E，Raffestin B，et al.Inhibition of matrix metalloproteinases by lung TIMP－1 gene transfer limits monocrotaline－induced pulmonary vascular remodeling in rats［J］.Hum Gene Ther，2003，14(9):861－869.

10 Cowan KN，Jones PL，Rabinovitch M.Elastase and matrix metalloproteinase inhibitors induce regression，and tenascin－C antisense prevents progression，of vascular disease［J］.J Clin Invest，2000，105(1):21 －34.

11 Vieillard－Baron A，Frisdal E，Eddahibi S，et al.Inhibition of matrix metalloproteinases by lung TIMP－1 gene transfer or doxycycline aggravates pulmonary hypertension in rats［J］.Circ Res，2000，87(5):418－425.

12 Junbao D，Hui Y，Bing W，et al.Effect of L－arginine on collagen of high flow－induced pulmonary arterial remodeling［J］.Circ J，2005，69(5):603－608.

13 Higuchi M，Yasuda O，Kawamoto H，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase－3 deficiency inhibits blood pressure elevation and myocardial microvascular remodeling induced by chronic administration of Nomeganitro－L－arginine methyl ester in mice［J］.Hypertens Res，2007，30(6):563－571.

14 Lemal^stre V，Soloway PD，D'Armiento J.Increased medial degradation with pseudoaneurysm formation in apolipoprotein E－knockout mice deficient in tissue inhibitor of metalloproteinases－1［J］.Circulation，2003，107(2):333－338.

15 Silence J，Collen D，Lijnen HR.Reduced atherosclerotic plaque but enhanced aneurysm formation in mice with inactivation of the tissueinhibitorofmetalloproteinase－1(TIMP－1)gene［J］.Circ Res，2002，90(8):897－903.

16 Chen P，Farivar AS，Mulligan MS，et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase－1 defi ciency abrogates obliterative airway disease after heterotopic tracheal transplantation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2006，34(4):464 －472.

17 Taddei ML，Giannoni E，Fiaschi T，et al.Anoikis:an emerging hallmark in health and diseases［J］.J Pathol，2012，226(2):380－393.

18 McCawley LJ，Matrisian LM.Matrix metalloproteinases:they're not just for matrix anymore!［J］.Curr Opin Cell Biol，2001，13(5):534－540.

19 Stetler－Stevenson WG.Tissue inhibitors of metalloproteinases in cell signaling:metalloproteinase－independent biological activities［J］.Sci Signal，2008，1(27):re6.

20 Peacock A.Pulmonary hypertension［J］.Eur Respir Rev，2013，22(127):20－25.

21 Hill JM，Zalos G，Halcox JP，et al.Circulating endothelial progenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk［J］.N Engl J Med，2003，348(7):593－600.

22 Akahane T，Akahane M，Shah A，et al.TIMP －1 inhibits microvascular endothelial cell migration by MMP－dependent and MMP－independent mechanisms［J］.Exp Cell Res，2004，301(2):158－167.

23 Murphy AN，Unsworth EJ，Stetler－ Stevenson WG.Tissue inhibitor of metalloproteinases－2 inhibits bFGF－induced human microvascular endothelial cells proliferation［J］.J Cell Physiol，1993，157(2):351 －358.

24 Seo DW，Li H，Guedez L，et al.TIMP－2 mediated inhibition of angiogenesis:an MMP－ independent mechanism［J］.Cell，2003，114(2):171－180.

25 Qi JH，Ebrahem Q，Moore N，et al.A novel function for tissue inhibitor of metalloproteinases－3(TIMP3):inhibition of angiogenesis by blockage of VEGF binding to VEGF receptor－2［J］.Nat Med，2003，9(4):407 －415.

26 Zhen－Zhou C，Xiao－Dan J，Gui－Tao L，et al.Functional and ultrastructural analysis of endothelial－like cells derived from bone marrow stromal cells［J］.Cytotherapy，2008，10(6):611－624.

27 Haack－Sorensen M，Bindslev L，Mortensen S，et al.The influence of freezing and storage on the characteristics and functions of human mesenchymal stromal cells isolated for clinical use［J］.Cytotherapy，2007，9(4):328 －337.

28 Mund JA，Ingram DA，Yoder MC，et al.Endothelial progenitor cells and cardiovascular cell－based therapies［J］.Cytotherapy，2009，11(2):103－113.

29 Tondreau T，Meuleman N，Stamatopoulos B，et al.In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflamatory cytokines:the role of their migration in injured tissues［J］.Cytotherapy，2009，11(5):559－569.

30 Huang PH，Chen YH，Wang CH，et al.Matrix metalloproteinase－9 is essential for ischemiainduced neovascularization by modulating bone marrowderived endothelialprogenitor cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(8):1179－1184.