特殊染色及免疫組化雙重染色在恒河猴糖尿病模型中的應(yīng)用

朱 華，徐艷峰，黃 瀾，劉 穎，秦 川

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

隨著人民生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率也逐年升高。但其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。糖尿病的防治已成為科學(xué)工作者的一個重要課題。研究資料表明，本病與遺傳、環(huán)境及免疫等多種因素有關(guān)。研究糖尿病的發(fā)病機(jī)制和抗糖尿病藥物的作用都需要建立合適的動物模型。對糖尿病動物模型的評價除血糖、C胎、胰島素、血生化等常規(guī)指標(biāo)，胰腺、腎臟等受侵害組織的病理學(xué)觀察也是評價模型成功與否的重要指標(biāo)。本文在使用小劑量多次注射鏈脲佐菌素(STZ)的方法成功誘導(dǎo)恒河猴糖尿病動物模型的基礎(chǔ)上，用特殊染色、免疫組化雙染的方法顯示胰腺等組織中的特征性病變，現(xiàn)介紹如下。

1 材料和方法

1.1 動物模型

成年雄性恒河猴5只，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，年齡4～6歲，體重5.5～6.5 kg。動物合格證號［SCXK-(軍)2007-001］。動物使用許可證號［SYXK(京)2010-0030］。模型制作方法見參考文獻(xiàn)［1］

1.2 切片制備

動物血糖逐漸升高，經(jīng)長期觀察，在瀕死狀態(tài)時股動脈放血處死。取胰腺、心臟、腎臟、脾臟、肝臟、眼球、腦等器官，10%中性甲醛液固定，組織經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，厚度4 μm。

1.3 染色方法

1.3.1 HE染色:所有切片均進(jìn)行 HE染色，根據(jù)H．E染色結(jié)果對分別對胰腺、腎臟、脾臟、肝臟等進(jìn)行Masson三色染色、PAS、甲苯胺藍(lán)、天狼星紅染色。染色方法見參考文獻(xiàn)［2］。

1.3.2 免疫組化雙重染色:切片經(jīng)脫蠟、水化、蒸餾水洗，進(jìn)行SP法雙重免疫組化染色。具體步驟如下:(1)3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，室溫10 min，PBS洗。(2)正常血清封閉15 min，滴加第一抗體混合液(rabbit anti-insulin，Santa Cruz公司產(chǎn)品，貨 號 SC-9618，稀 釋 度 1∶300;mouse antiglucagon，福建邁新，貨號 BM1621，稀釋度 1∶200)，4℃過夜，PBS沖洗。(3)滴加第二抗體混合液(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG聚合物，堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG聚合物等比例混合，北京中杉金橋，貨號 DS-0001)，室溫孵育 30 min，PBS沖洗。(4)DAB顯色1～5 min(北京中杉金橋，貨號DS-0001)，顯微鏡下控制顯色程度，蒸餾水終止顯色。(5)AP-red顯色(北京中杉金橋，貨號 DS-0001)5～10 min，鏡下觀察顯色程度。(6)蘇木素襯染后甘油封片。

2 結(jié)果

2.1 HE及特殊染色

模型動物的胰島萎縮，數(shù)量減少，胰島內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，部分胰島細(xì)胞固縮，細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮紅染，胞核圓形深染(圖1A)。Masson染色外分泌部間質(zhì)內(nèi)纖維增生，灶狀腺泡萎縮(圖2E)。間質(zhì)大血管壁平滑肌增厚，血管周圍結(jié)締組織增生。視網(wǎng)膜神經(jīng)元變性、數(shù)量減少、排列紊亂(圖1C)。脾臟白髓萎縮(圖1D)，天狼星紅染色可見中央動脈管壁增厚(圖2D)。局灶性慢性腎炎，病變區(qū)腎間質(zhì)纖維組織增生，少量炎細(xì)胞浸潤，腎小球及腎小管萎縮。部分腎小管擴(kuò)張。腎臟內(nèi)小動脈管壁增厚個別腎小球球囊腔消失，臟層及壁層上皮細(xì)胞融合，毛細(xì)血管腔閉鎖。(圖1E，F(xiàn);圖2B)。心內(nèi)膜小灶性炎細(xì)胞浸潤(圖1B)。肥大細(xì)胞脫顆粒(圖 2F)。

2.2 免疫組化染色

胰島A細(xì)胞增生，細(xì)胞密集，胰高血糖素表達(dá)增多，胞漿呈棕褐色，細(xì)胞核藍(lán)色。B細(xì)胞數(shù)量減少，胰島素表達(dá)減少，胰島細(xì)胞分布雜亂，胞漿粉紅色，細(xì)胞核藍(lán)色(圖3，圖1～3見文后彩插1～2)。

3 討論

糖尿病模型研究需要形態(tài)學(xué)提供直觀的結(jié)果支持。而形態(tài)學(xué)研究在很大程度上依賴于通過染色顯示出各臟器的病理變化。常用的蘇木素-伊紅(HE)染色，只能顯示一般組織結(jié)構(gòu)及病變，但一些特異的組織成分、化學(xué)物質(zhì)等，則需要用特殊染色方法進(jìn)行分析與鑒別［3］。免疫組織化學(xué)問世后，組織和細(xì)胞中大部分化學(xué)成分和一些反應(yīng)基團(tuán)都可以用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測，許多特殊染色方法被免疫組織化學(xué)染色所替代［4］。但特殊染色具有定性準(zhǔn)確、方法簡單、結(jié)果可靠的特點(diǎn)，在科研工作中做對比觀察可起到相互印證作用［5］。如膠原纖維在HE染色中呈均一的粉紅色，與周圍間質(zhì)區(qū)分不是很清楚。網(wǎng)狀纖維在HE染色中不易顯色。HE染色中也無法顯示細(xì)胞中糖原顆粒的沉積。而STZ誘導(dǎo)的I型糖尿病的主要病理改變之一即胰島纖維化和糖原堆積引起的腎小球基底膜增厚繼而導(dǎo)致腎小球硬化癥［6］。本研究在 HE染色基礎(chǔ)上，通過Masson三色染色法顯示胰島及胰腺外分泌部中增多的網(wǎng)狀纖維，通過天狼猩紅染色顯示脾臟膠原纖維增多導(dǎo)致動脈管壁增厚，用PAS染色法顯示腎小球系膜基質(zhì)增生，基底膜增厚，取得了滿意效果。

胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞損傷時形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為胰島萎縮、B細(xì)胞凋亡，細(xì)胞數(shù)量減少，殘存B細(xì)胞肥大代償，A細(xì)胞增生。要觀察模型動物胰腺A、B細(xì)胞情況，普通HE染色切片無法辨別，而單一的免疫組化染色因切片的不一致，觀察結(jié)果存在一定主觀性。本研究采用免疫組化雙重染色技術(shù)，在同一張切片上顯示A、B細(xì)胞分泌顆粒的表達(dá)情況，結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致［7］。在染色過程中對實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行優(yōu)化，采用不同眾種屬來源和標(biāo)記系統(tǒng)的一抗和二抗混合孵育，分別顯色，與一抗、二抗單獨(dú)反應(yīng)相比，大大減少了操作時間而并不影響反應(yīng)結(jié)果。但要注意顯色時要先用DAB對辣根酶進(jìn)行顯色，再用AEC對堿磷酶顯色。因?yàn)锳EC為較淺的粉紅色，且顯色時間較長。如果先顯色，易被較深的棕色DAB所覆蓋。

本文在使用STZ成功誘導(dǎo)恒河猴糖尿病動物模型后，利用HE染色結(jié)合能體現(xiàn)糖尿病特征性病理改變的特殊染色和免疫組織化學(xué)雙重染色法可更好的對模型進(jìn)行組織病理學(xué)評價，為模型的應(yīng)用提供參考。

［1］ 朱華，劉穎，馬春梅，等．STZ誘導(dǎo)恒河猴糖尿病動物模型的建立［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(6):53－56．

［2］ 潘琳．實(shí)驗(yàn)性糖尿病病理圖譜［M］．北京:科學(xué)出版社，2007:187－194．

［3］ 高美欽，袁芳平，黃愛民，等．彈力纖維染色與免疫組織化學(xué)雙重染色技術(shù)［J］．中華病理學(xué)雜志，2003，32(2):176－177．

［4］ TaylorCR． The totaltestapproach to standardization of immunohistochemistry［J］．Arch Pathol Lab Med，2000，124(7):945－951．

［5］ 胥維勇．現(xiàn)代病理學(xué)條件下特殊染色的應(yīng)用價值［J］．實(shí)用醫(yī)技雜志，2012，19(3):313－314．

［6］ Kenneth NL，William TC，Janice DW．Streptozotocin-induced diabetes mellitus in cynomolgus monkeys: changes in carbohydrate metabolism，skin glycation and pancreatic islets［J］．Lab Anim Sci，1998，48(2):172 －178．

［7］ Wagner JD，Carlson CS，O＇Brien TD，et al．Diabetes mellitus and islet amyloidosis in cynomolgus monkeys［J］．Lab Anim Sci．1996，46(1):36－41．