腦血栓患者治療前后血小板膜糖蛋白CD62p水平的比較

王朝輝 鞠文博 黃競(jìng)妍 (北華大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 吉林 132013)

血小板的主要功能就是參與血栓形成，該功能的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)其表面的糖蛋白來(lái)完成的，血小板膜表面糖蛋白包括血小板質(zhì)膜糖蛋白和顆粒膜糖蛋白。較重要的血小板質(zhì)膜糖蛋白有CD41(GPⅡb，CD61(GPⅢa)，CD42a(GPⅨ)，CD42b(GPIb)，CD36(GPIV)〔1〕。在正常情況下，血小板內(nèi)α-顆粒膜糖蛋白和溶酶體膜糖蛋白(cD63)處于靜息狀態(tài)，在血小板活化因子等因素刺激下，Q-顆粒膜和溶酶體膜與血小板胞漿膜融合，血小板表面CD62p、CD63表達(dá)而成為活化血小板，其黏附、聚集功能顯著增強(qiáng)〔2〕。各種因子的作用使靜息狀態(tài)下血小板膜糖蛋白迅速發(fā)生數(shù)量重排和構(gòu)型變化，與血漿中相應(yīng)物質(zhì)結(jié)合而使血小板聚集，同時(shí)血小板內(nèi)發(fā)生各種分泌反應(yīng)，促進(jìn)血栓形成。這些糖蛋白主要包括CD62p、CD42b、GPⅡb/Ⅲa等，其表達(dá)多少，直接反映血小板功能狀態(tài)。為了確定這些指標(biāo)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板膜糖蛋白，即主要檢測(cè)CD62p、CD42b、GPⅡb/Ⅲa等指標(biāo);探討其在腦血栓疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 本科室腦血栓患者60例(腦血栓組)，男40例，女20例，平均年齡68歲，治療用藥以?shī)W扎格雷為主。對(duì)照組為門(mén)診健康查體者60例，平均年齡60歲，男40例，女20例。體檢正常，既往無(wú)心腦血管、高血壓、糖尿病病史，測(cè)定前2 w內(nèi)未服用影響血小板功能的藥物。

1.2 主要試劑和儀器 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗CD62p抗體，藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD42b抗體，均購(gòu)自美國(guó)Bectondickion公司;多聚甲醛，天津科密化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;磷酸鹽緩沖液(PBS)，德國(guó)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司。主要儀器:FACSCalibur流式細(xì)胞儀、Falocn上樣管、CTAD真空采血管均購(gòu)自美國(guó) Bectondickion公司;KX-21型血細(xì)胞分析儀，日本sysmxe公司。

1.3 樣品處理 分別在治療前及治療后2、4、8 w取靜脈血1.8 ml，置于含0.2 ml 3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑離心管中，混勻。離心(800 r/min，5 min)，分離得到富血小板血漿，加入等量2%多聚甲醛(終濃度為1%)固定15 min，用PBS-EDTA緩沖液懸浮血小板并洗滌2次(1 000 r/min，15 min)，然后血小板懸浮于PBS-EDTA緩沖液中并調(diào)節(jié)血小板濃度為1×1010L－1。

1.4 熒光染色 試驗(yàn)管中加血小板100 μl FITC標(biāo)記的抗CD62p 抗體20 μl，PE 標(biāo)記的 CD42b 抗體20 μl混勻，室溫下避光 30 min。PBS洗滌2 次(1 000 r/min，15 min)，用0.5 ml PBS懸浮并轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀，上機(jī)檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析 前向角和側(cè)向角均采用對(duì)數(shù)放大，設(shè)門(mén)選取血小板，每份樣品收集20 000個(gè)血小板，記錄其熒光標(biāo)記抗體的陽(yáng)性百分比。Cellquest軟件分析計(jì)算CD42b、CD62p的陽(yáng)性表達(dá)率(%)。

1.7 結(jié)果 治療后2、4、8 w血漿CD62p水平分別為(32.23±8.56)%，(24.25±8.38)%，(12.24±6.38)%，明顯低于治療前〔(50.25±9.82)%〕(P＜0.01)，但均高于對(duì)照組〔(3.23±0.56)%〕(P＜0.01)。

2 討論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究〔3〕表明，腦梗死的發(fā)生發(fā)展涉及多種因素，其中活化血小板在腦血栓的啟動(dòng)、形成和擴(kuò)展過(guò)程中起重要作用，而血漿CD62p是活化血小板特異性標(biāo)志〔4〕。

CD62P，又稱GMP-140，P-選擇素，選擇素超家族的成員之一，CD62P是一種血小板膜糖蛋白，它選擇性地分布于巨核細(xì)胞和靜止血小板內(nèi)，非活化血小板胞質(zhì)內(nèi)α顆粒含有CD62p，血小板活化時(shí)，α顆粒迅速與血小板膜融合并釋放CD62p，使后者顯露于血小板表面〔5〕。在正常血小板表面僅存在700個(gè)分子，血小板受刺激活化后，α顆粒迅速與血小板膜融合并釋放，使CD62p重新分布于血小板表面，且CD62p只在活化血小板表面表達(dá)，不被血漿蛋白質(zhì)所掩蓋，不隨時(shí)間推移而在活化血小板表面消失，血小板表面CD62p可反映血小板的活化狀態(tài)，所以CD62p的表達(dá)是血小板活化的特征性指標(biāo)〔6〕。

CD62p也整合到血小板膜上，介導(dǎo)血小板與單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的黏附，故CD62p是活化血小板或內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞相互作用的主要橋梁。通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CD62p也是中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞的受體，通過(guò)CD62p參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附過(guò)程，使血小板與中性白細(xì)胞黏附、聚集、加固、并機(jī)化血栓。另外，當(dāng)血小板或內(nèi)皮細(xì)胞活化時(shí)，CD62p還可以釋放到血漿中，血漿中的CD62p含量的測(cè)定也反映體內(nèi)血小板活化程度及血栓形成傾向。近年來(lái)研究同時(shí)表明CD62p作為細(xì)胞膜表面的黏附分子，能介導(dǎo)血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞〔7〕，單核細(xì)胞間的相互黏附、聚集。具有啟動(dòng)、放大血栓形成的重要作用，在炎癥和栓塞中起著中心環(huán)節(jié)作用〔8〕。

因此利用CD62p這一特征觀察或鑒別患者體內(nèi)血小板、內(nèi)皮細(xì)胞激活狀態(tài)。對(duì)炎癥損傷、血栓性疾病等臨床研究、疾病診斷與治療均具有重要意義〔9〕。最初一些學(xué)者在自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、混合性結(jié)締組織病)，糖尿病及腎臟疾病等進(jìn)行血漿CD62p檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有不同程度增高，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在血栓形成尤見(jiàn)，但正常人血漿中也有可溶性CD62p，但濃度相對(duì)較低 。

腦血栓疾病是因不同原因?qū)е履X血管中流動(dòng)的血液變成固體，致使血流發(fā)生不同程度受阻后形成的綜合病征。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板活化具有簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，且能準(zhǔn)確反映出血小板活化程度及功能狀態(tài)，可作為血小板活化研究重要手段〔11，12〕。本實(shí)驗(yàn)提示臨床檢測(cè)CD62p具有診斷和治療意義。

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