人椎間盤髓核組織工程研究進展

張子言 佟 珅 顏華東 姜 睿 武 漢 (吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 130033)

腰痛是老年人群中的常見病和多發病，構成了一個可觀的流行病學和經濟學問題。盡管目前醫學的診斷及治療技術不斷進步，但隨老年人逐漸增多，發病率表現為上升趨勢〔1〕。腰痛造成極大的經濟負擔，在英國每年導致花費120億英鎊〔2〕，美國為1 000億美元〔3〕。盡管引起腰痛的原因有許多，但是一個很明顯的原因是與椎間盤(IVD)的退變密切相關。組織工程提供了將已退變的椎間盤恢復正常功能的方法，具有光明的前景。大多數研究直接指向了髓核(NP)組織工程，因為間盤退變被認為起源于NP區域，在過去10年中，對于這個問題已取得了相當大的進展。

1 IVD的生物學

IVD的解剖包括3個部分:纖維環(AF)，NP和終板(EP)。AF、NP三明治一樣位于兩塊軟骨終板之間，使相鄰椎體成為一個整體〔4，5〕。外側AF承受張力(圓周的，軸向的和旋轉的)，NP承受壓縮力，內側AF則受二者的混合作用〔4，5〕。這些結構組合起來能夠承受比單一組織更大的負荷，體現了保持完整復合結構的重要性。軟骨終板在維持NP細胞活性上起關鍵作用〔6，7〕，它可防止NP突出至相鄰椎體。因此這三種組織結構對保持IVD的正常功能是十分重要的。

2 IVD的退變

IVD退變常開始于人一生中的第二個十年，隨年齡增長而發展，缺乏營養供應和不適當的機械負荷都可導致IVD細胞生存能力和IVD功能丟失或改變。NP基質的破壞源自合成和退變之間的不平衡，導致NP區域與水結合能力降低。在病理學中，退變的NP基質不再能夠有效的承受負荷，其結果是發生IVD退變。同時，AF良好的薄片結構開始退化，最后發展到從內側延伸到外圍的撕裂。

3 IVD退變的治療

目前IVD退變的治療包括非手術治療和手術治療。非手術治療包括生活方式改變(例如:降低體重，戒煙)，物理康復治療(例如:鍛煉，熱/冷刺激，電刺激，針灸和牽引)以及使用止痛藥物。當非手術方法不能緩解疼痛時，融合術仍舊是外科的標準療法〔8〕。這種治療具有巨大創傷，目的在于消除關節位置的活動，從而阻止疼痛。盡管臨床上經常應用這種療法，但是融合術常常達不到緩解疼痛的目的，還可能加速鄰近IVD的退變性改變 。全間盤人工置換術是近來應用的一種外科治療方式，目的在于維持節段的活動性。但是，它的遠期效果尚未得到證實，人工IVD結構的磨損對于該治療的遠期效果來說具有挑戰性和風險性〔10〕，考慮到人工IVD移植手術有大量的臨床禁忌證以及有可能造成災難性的并發癥，這一方式有效性的證實仍需長期隨訪得來的數據的支持。

4 組織工程和IVD

組織工程中3種主要的組分，包括細胞，信號和支架。信號包括生物力學因素(機械負荷)和生物化學因子(細胞活素，酶，酶抑制劑和生長因子等)，其中生長因子已得到廣泛研究〔11〕。

4.1 細胞因子 應用細胞因子促進IVD組織細胞功能活性的再生已成為目前骨科領域研究的熱點，一些體內研究也證明該觀點的有效性。

目前研究最多的與IVD退變相關的細胞因子有轉化生長因子-β(TGF-β)〔12，13〕，胰島素樣生長因子 1(IGF-1)〔14〕，血小板生長因子(PDGF)〔14〕，成骨蛋白-1/骨形態蛋白-7(OP-1/BMP-7)〔13，15〕，BMP-2 和 BMP-12〔16，17〕，以及近幾年成為研究熱點的GDF-5〔18～20〕。

GDF-5〔21〕被認為是軟骨形態蛋白-1(CDMP-1)和 BMP-14，是GDF家族的一員，與骨形態蛋白緊密相關。GDF-5主要的作用是刺激基質產生和IVD細胞的增殖。Walsh等〔22〕使用靜態壓力誘導了鼠尾間盤的退變，隨后研究了體內不同生長因子的治療作用。單獨注射GDF-5明顯刺激了IVD高度的增加，但是IGF-1、TGF-β 或 bFGF 沒有這種效應。Masuda等〔15〕發現 rhGDF-5在牛的NP和AF細胞中，能夠增加細胞的繁殖和基質的合成，NP細胞比AF細胞的應答效應更加明顯。他們還報道了在兔間盤退變模型中，向NP區域注射rhGDF-5誘導了間盤高度的恢復和改善，并由組織學和MRI分析所證實。最新的證據顯示〔18〕，GDF-5療法能夠改進NP細胞的成軟骨細胞特征。

參與分解代謝的細胞因子有 IL-1、神經生長因子(NGF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及金屬基質蛋白酶(MMPs)等，可促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解。無論是體外細胞培養還是體內動物實驗，都發現 MMPs(MMP-1，3，9，10)普遍存在于退變的IVD中，并且含量較高，提示其參與細胞外基質(ECM)的降解〔23，24〕。

4.2 細胞 NP細胞主要為脊索殘留細胞，隨著個體的發育成熟而逐漸消失，最終被軟骨樣細胞所替代。在動物模型中IVD的退行性變均在脊索源性細胞消失后才出現，盡管人類發育高峰期稍推后，但脊索源性細胞的消失和IVD退行性變間確實存在著某種密切關聯，有待進一步的研究〔25〕。理論上，延緩NP退變需要移植同源自體NP細胞，但是很難想象能夠從需要替代的退變組織中獲取健康細胞。同樣，從技術上和倫理學角度上獲取健康人類的NP細胞是困難的，因為大多數IVD手術中切除的是已退變的NP。近來，永生化的人類NP細胞系已被研究出來，考慮可用于臨床應用〔26〕。為了修復退變NP組織的基質，移植的細胞必須產生大量的蛋白聚糖(例如聚集蛋白多糖)，膠原蛋白和其他基質蛋白。軟骨細胞和來自IVD中央區域的細胞通常產生這些基質蛋白，這使得他們可作為IVD修復的候選細胞。目前可供選擇的種子細胞包括捐獻的異體間盤細胞、自體軟骨細胞和干細胞。間充質干細胞(MSC)同樣被認為是一種活躍的，對 NP 退變的潛在的治療選擇〔14，27～30〕。而且，過去10年中對干細胞研究的進展，顯示將成人MSCs用于NP 組織工程是很有前景的〔11，21，31～35〕。MSCs 的最初研究由Friedenstein和他的同事完成，已超過了40年。目前已被廣泛認可，MSCs有分化為不同間葉起源細胞系的能力，包括軟骨細胞、成骨細胞和脂肪細胞系，分化結果取決于不同的生物學環境，能夠獲得多種成人組織，例如骨髓、骨小梁、關節軟骨、肌肉和脂肪。

脂肪干細胞(ADSC)在骨和軟骨修復中作為一種細胞資源已得到密切關注〔13〕。尤其，在最近的研究中，在NP組織退變中應用 ADSCs，研究結果令人備受鼓舞〔20，36〕。Lu 等〔37〕報道了將人類ADSCs和NP細胞以微塊方式共培養，導致ADSCs向類NP細胞表現型方向分化。Tapp等〔20〕透露在三維培養的沙鼠ADSCs用TGF-b處理或與人類IVD細胞共培養都可以明顯刺激蛋白聚糖和Ⅰ型膠原表達。Gaetani等〔36〕呈現的數據提示在基質合成和三維細胞組織中，人類NP細胞和ADSCs共培養能增加體外重構組織的質量。另一方面，細胞擴增的基本要求是達到移植的有效細胞數量，傳統單層細胞培養方式存在一些不足，包括細胞的分化、衰老和基因突變〔33〕。ADSC的一大優點是可以在門診病人身上通過微創方式輕易獲取脂肪組織，周圍組織ADSCs的含量可達到25 000/g。Minogue等〔38〕發現盡管MSCs和ADSCs都可以分化為NP細胞，但相對于MSCs而言，ADSC向NP分化的細胞表型與NP細胞相似性更高，因此更適合于NP組織工程。因此，在臨床應用中，脂肪組織可以被認為是干細胞的合適來源，在獲得程序上簡易，細胞數量上達標。

4.3 NP的支架 當設計一個用于組織工程的支架時，需要考慮到許多因素，例如免疫原性、結構性和力學性能，生物相容性和生物降解性以及采用何種移植方法〔17〕，理想的組織工程支架材料應具備以下條件〔39〕:良好的組織相容性;具有可塑性，并有一定的機械強度;具有三維立體結構，一方面有利于細胞的植入黏附，另一方面有利于營養成分的滲入和細胞代謝產物的排出;此外，還應該具有較好的生物可降解性，在組織形成過程中逐漸分解，不影響新形成組織的結構和功能。目前已報道的有貝殼或羥基磷灰石貝殼、褐藻膠、蛋白聚糖/端膠原凝膠、透明質酸、磷酸鈣、聚左旋-乳膠(PDLA)、去礦化骨基質(DBM)和小腸黏膜下層(SIS)〔11〕等。

隨著微創手術的不斷發展，在手術治療以后應用注射型支架來增加NP組織含量已應用多年。自1974年硅膠第一次應用于IVD置換以來，已經發展出了很多注射用的生物材料，例如透明質酸，纖維蛋白，類彈性蛋白多肽，Ⅰ型膠原蛋白，Ⅱ型膠原蛋白褐藻膠和殼聚糖〔40，41〕。

殼聚糖，起源于部分解聚和去乙酰膽堿的殼質，是甲殼綱動物殼的主要組分，具有突出的生物學性能，如組織相容性，生物退變性和抗細菌活性。這些性能與它特殊的物理和化學組成相一致，使它成為骨科組織工程中一種多功能的生物高分子聚合物〔42〕。尤其是，作為一種凝膠制劑，它能夠形成轉換pH或溫度的凝膠。已證實帶有甘油磷酸或磷酸氫銨(AHP)的殼聚糖的組合能夠產生一種熱感應凝膠，在室溫下是液體，在生理溫度下為固體〔43，44〕。這種性能能夠使殼聚糖凝膠用來IVD內注射。凝膠被推薦為一種理想的用來NP置換的候選支架材料，因為它們與天然組織機械性能相近〔45〕。目前已有兩項研究提供了使用殼聚糖/甘油磷酸凝膠作為支架的證據，文獻顯示它們能維持牛的NP細胞的生存能力和功能〔46〕，進而在不同的培養基中〔47〕誘導人類MSCs向類NP細胞分化。

組織工程為NP退變的治療提供了一個新的途徑，這一技術已在臨床治療軟骨損傷中得到應用。一般通過兩種途徑實現:(1)分離IVD細胞種植于基質，體外生長以達到需要的組分，然后移植到退變IVD中。(2)使用可降解的高分子聚合物附加于細胞上，將混合有高分子聚合物的細胞注射入IVD，在IVD中原位增殖〔48〕。NP再生的臨床研究中顯示，使用自體同源的IVD軟骨細胞移植(ADCT)能明顯減輕疼痛，尋找適合的載體將增強這一方法的治療潛力〔49〕。因此，研究注射型支架是十分必要的。一些研究者已對NP細胞體外培養的培養環境和支架進行了大量研究。

自體同源軟骨細胞移植法(ACT)用于治療軟骨疾病是一種越來越流行的方法。Gorensek等〔50〕將新西蘭大白兔的NP從IVD中移出，替代以耳部軟骨來源的軟骨細胞。他們的研究顯示耳部軟骨來源的ACT能移植替代NP。Mizuno等〔51〕嘗試重構混合性IVD結構，包含種植于PGA的AF和NP細胞，各自帶有海藻支架，樣本移植于無胸腺大鼠皮下。他們的研究顯示，在臨床應用中，創造一個帶有與天然組織類似組成和力學性能的混合型IVD是可行的。

Hamilton等〔52〕研究了體外重建IVD三維結構的可能性，它包含NP和軟骨終板和帶孔鈣磷酸鹽替代性骨。牛關節軟骨種植于帶孔鈣磷酸鹽的表面，允許體外培養形成軟骨和NP細胞放置于體外培養形成的透明軟骨之上。它們的研究顯示了生成復合結構的可能性，包含類終板軟骨層，從而使替代IVD的骨組織界面間特性變得更好。IVD的組織工程使用MSCs誘導分化為IVD細胞表型，這已被認為是IVD退變治療的可供選擇之一。

成功的組織工程NP移植應該具有近似天然組織的功能。由于目前缺乏關于它們生物學表型的足夠知識，NP細胞的特征仍需進一步明確。特定的細胞標記物如CD24、缺氧誘導因子-1(HIF-1)、葡萄糖輸送因子-1(GLUT-1)、MMP-2、雕刻蛋白3(GPC3)和角蛋白 19(K19)被認為是有益的參考〔35，53～55〕，尤其是Risbud等〔35〕認為HIF-1α能作為髓核細胞的表型標記物，從而用于鑒定髓核細胞。

5 展望

NP組織工程提供了治療人IVD退變的美好前景。但是，距離臨床應用仍很遙遠。至今大部分體內實驗數據都是從鼠和犬類模型獲得的。但在這些動物IVD內存在脊索細胞，有可能轉變成NP細胞，而人類脊索細胞僅存在于胚胎期并且出生后很快消失，這在很大程度上限制了實驗數據的應用。盡管體外動物實驗種類較多，但是由于動物退變模型的營養情況好于人類 IVD，兩者退變過程不一致，造模還是不能精確模擬人類IVD退變的過程，從而影響對退變機制的認知。

應用組織工程學方法，對退變NP進行干預，是為了延緩或逆轉IVD退變，目前還處于研究的初期階段。IVD中心區域無血供，營養差，移植的細胞存活問題較為突出，而注射到退變IVD內的細胞因子也不易發揮有效作用，因此如何解決退變IVD的營養供應有待于進一步研究。

通過組織工程學的方法，有機結合細胞移植、細胞因子及(或)轉基因技術復合支架植入病變NP，修復甚至重塑NP，改善細胞外基質營養成分，增加NP含水量，恢復變窄、塌陷腰椎間隙，修復受損的纖維環裂口，改善軟骨終板的營養供應，是NP組織工程研究的價值所在。

1 Anderson DG，Albert TJ，Fraser JK，et al.Cellular therapy for disc degeneration〔J〕.Spine，2005;30:14-19.

2 Maniadakis N，Gray A.The economic burden of back pain in the UK〔J〕.Pain，2000;84(1):95-103.

3 Bradford DS，Berven SH，Hu S.Intervertebral disc replacement:a role in the management of chronic low back pain caused by degenerative disc disease〔J〕.Spineuniverse，2002;1:2004.

4 Hukins DW.Disc structure and function.In:Ghosh P，ed.Biology of intervertebral disc〔M〕.Boca Raton:CRC Press;1988:2-37.

5 Simon SR.Kinesiology.In:Simon SR，ed.Ortho-pedic basic science〔M〕.USA:Am Academy of Orthopedic Surgeons;1994:558-68.

6 Mizuno H，Roy AK，Zaporojan V，et al.Biomechanical and biochemical characterization of composite tissue-engineered intervertebral discs〔J〕.Biomaterials，2006;27(3):362-70.

7 Horner HA，Urban JP.2001 Volvo Award Winner in Basic Science Studies:effect of nutrient supply on the viability of cells from the nucleus pulposus of the intervertebral disc〔J〕.Spine，2001;26(23):2543-9.

8 Deyo RA，Gray DT，Kreuter W，et al.United States trends in lumbarfusion surgery for degenerative conditions〔J〕.Spine(Phila Pa 1976)，2005;30:1441-7.

9 Harrop JS，Youssef JA，Maltenfort M，et al.Lumbar adjacent segment degeneration and disease after arthrodesis and total disc arthroplasty〔J〕.Spine，2008;33:1701-7.

10 Resnick DK，Watters WC.Lumbar disc arthroplasty:a critical review〔J〕.Clin Neurosurg，2007;54:83-7.

11 O'Halloran DM，Pandit AS.Tissue-engineering approach to regenerating the intervertebral disc〔J〕.Tissue Eng，2007;13:1927-54.

12 Matsunaga S，Nagano S，Onishi T，et al.Age-related changes in expression of transforming growth factor-beta and receptors in cells of intervertebral discs〔J〕.J Neurosurg，2003;98:63-7.

13 Tapp H，Hanley EN Jr，Patt JC，et al.Adipose-derived stem cells:characterization and current application in orthopaedic tissue repair〔J〕.Exp Biol Med(Maywood)，2009;234:1-9.

14 Saka DI，Mochida J，Iwashina T，et al.Regenerative effects of transplantingmesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degeneratedintervertebral disc〔J〕.Biomaterials，2006;27(1):335-45.

15 Masuda K，Imai Y，Okuma M，et al.Osteogenic protein-1 injection into a degenerated disc induces the restoration of disc height and structural changes in the rabbit anular puncture model〔J〕.Spine，2006;31:742-54.

16 Gilbertson L，Ahn SH，Teng PN，et al.The effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2，recombinant human bone morphogenetic protein-12，and adenoviral bone morphogenetic protein-12 on matrix synthesis in human annulus fibrosis and nucleus pulposus cells〔J〕.Spine，2008;8:449-56.

17 Huang KY，Yan JJ，Hsieh CC，et al.The in vivo biological effects of intradiscal recombinant human bone morphogenetic protein-2 on the injured intervertebral disc:an animal experiment〔J〕.Spine，2007;32:1174-80.

18 Chujo T，An HS，Akeda K，et al.Effects of growth differentiation factor-5 on the intervertebral disc—in vitro bovine study and in vivo rabbit disc degeneration model study〔J〕.Spine，2006;31:2909-17.

19 Cui M，Wan Y，Anderson DG，et al.Mouse growth and differentiation factor-5protein and DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenic gene expression〔J〕.Spine，2008;8:287-95.

20 Tapp H，Deepe R，Ingram JA，et al.Adipose-derived mesenchymal stem cells fromthe sand rat:transforming growth factor beta and 3D coculturewith human disc cells stimulate proteoglycan and collagen type I rich extracellular matrix〔J〕.Arthr Res Ther，2008;10:R89.

21 Steck E，Bertram H，Abel R，et al.Induction of intervertebral disclike cells from adult mesenchy-mal stem cells〔J〕.Stem Cells，2005;23:403-11.

22 Walsh AJ，Bradford DS，Lotz JC.In vivo growth factor treatment of degenerated intervertebral discs〔J〕.Spine，2004;29:156-63.

23 Stephen MR，Paul D.Increased expression of matrix metalloproteinase-10，nerve growth factor and substance P in the painful degenerate intervertebral disc〔J〕.Arthritis Res Ther，2009;4:126.

24 Zigouris A，Batistatou A，Alexiou GA.Correlation of matrix metallo-proteinases-1 and-3 with patient age and grade of lumbar disc her-niation〔J〕.J Neurosurg Spine，2011;2:268-72.

25 Praemer A，Furuer S，Rice DP.Musculoskeletal conditions in the United States〔M〕.Am Acad Orthoscopic Surg，1999:334-6.

26 Iwashina T，Mochida J，Sakai D，et al.Feasibility of using a human nucleus pulposus cellline as a cell source in cell transplantation therapy for intervertebral disc degeneration〔J〕.Spine，2006;31(5):1177-86.

27 Ganey TM，Meisel HJ.A potential role for cell-based therapeutics in the treatment of intervertebral disc herniation〔J〕.Eur Spine，2002;11(10):206-14.

28 Meisel HJ，Ganey T，Hutton WC，et al.Clinical experience in cellbased therapeutics:intervention and outcome〔J〕.Eur Spine，2006;15(8):397-405.

29 Richardson SM，Walker RV，Parker S，et al.Intervertebral disc cellmediated mesenchymal stem cell differentiation〔J〕.Stem Cells，2006;24(5):707-16.

30 Leung VY，Chan D，Cheung KM.Regeneration of intervertebral disc by mesenchymal stem cells:potentials，limitations，and future direction〔J〕.Eur Spine，2006;15(8):406-13.

31 Hiyama A，Mochida J，Iwashina T，et al.Transplantation of mesenchymalstem cells in a canine disc degeneration model〔J〕.Orthop Res，2008;26:589-600.

32 Jandial R，Aryan HE，Park J，et al.Stemcell-mediated regeneration of the intervertebral disc:cellular and molecular challenge〔J〕.Neurosurg Focus，2008;24:E21.

33 Kandel R，Roberts S，Urban JP.Tissue engineering and the intervertebral disc:the challenges〔J〕.Eur Spine，2008;17:480-91.

34 Richardson SM，Hughes N，Hunt JA，et al.Human mesenchymal stem cell differentiation to NP-likecells in chitosan-glycerophosphate hydrogels〔J〕.Biomaterials，2008;29:85-93.

35 Risbud MV，Guttapalli A，Stokes DG，et al.Nucleus pulposuscells express HIF-1 alpha under normoxic culture conditions:ametabolic adaptation to the intervertebral disc microenvironment〔J〕.Cell Biochem，2006;98:152-9.

36 Gaetani P，Torre ML，Klinger M，et al.Adipose-derived stem cell therapy for intervertebral disc regeneration:an in vitro reconstructed tissue in alginate capsules〔J〕.Tissue Eng Part A 2008，14:1415-23.

37 Lu ZF，Doulabi BZ，Wuisman PI，et al.Differentiation of adipose stem cells by nucleus pulposus cells:configuration effect〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2007;359:991-6.

38 Minogue BM，Stephen M.Characterization of the human nucleus pulposus cell phenotype and evaluation of novel marker gene expression to define adult stem cell differentiation〔J〕.Arthritis Rheumatism，2010;62(12):3695-705.

39 Halloran DO，Grad S，Stoddart M，et al.An injectable cross-linked scaffold for nucleus pulposus regeneration〔J〕.Biomaterials，2008;29(4):438-47.

40 Chou AI，Nicoll SB.Characterization of photocrosslinkedalginate hydrogels for nucleus pulposus cell encapsulation〔J〕.Biomed Mater Res A，2009;91(1):187-94.

41 Huang B，Li CQ，Zhou Y，et al.Collagen Ⅱ/hyaluronan/chon-droitin-6-sulfate tri-copolymer scaffold for nucleus pulposus tissue engineering〔J〕.J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2010;92(2):322-31.

42 Di Martino A，Sittinger M，Risbud MV，et al.Chitosan:a ver-satile biopolymer for orthopaedic tissue-engineering〔J〕.Biomaterials，2005;26:5983-90.

43 Cho J，Heuzey MC，Be'gin A，et al.Physical gelation of chitosan in the presence of beta-glycerophosphate:the effect oftemperature〔J〕.Biomacromolecules，2005;6:3267-75.

44 Nair LS，Starnes T，Ko JW，et al.Development of injectable thermogelling chitosan-inorganic phosphate solutions for biomedical applications〔J〕.Biomacromolecules，2007;8:3779-85.

45 Bader RA，Rochefort WE.Rheological characterization of photopolymerized poly(vinyl alcohol)hydrogels for potential use in nucleus pulposus replacement〔J〕.J Biomed Mater Res A，2008;86:494-501.

46 Roughley P，Hoemann C，DesRosiers E，et al.The potential of chitosan-based gels containing intervertebral disc cells for nucleus pulposus supplementation〔J〕.Biomaterials，2006;27:388-96.

47 Richardson SM，Hughes N，Hunt J，et al.Human mesenchymal stem cell differentiation to NP-like cells in chitosan-glycerophosphate hydrogels〔J〕.Biomaterials，2008;29:85-93.

48 Alini M，Roughley PJ，Antoniou J，et al.A biological approach to treating disc degeneration:not for today，but maybe for tomorrow〔J〕.Eur Spine J，2002;11(10):215-20.

49 Meisel HJ，Ganey T，Hutton WC，et al.Clinical experience in cellbased therapeutics:intervention and outcome〔J〕，Eur Spine，2006;15(8):397-405.

50 Gorensek M，Joksimovic C，Kregar-Velikonja N，et al.Nucleus pulposus repair with cultured autologous elastic cartilage derived chondrocytes〔J〕.Cell Mol Biol Lett，2004;9:363-73.

51 Mizuno H，Roy AK，Vacanti CA，et al.Tissue-engineered composites of anulus fibrosus and nucleus pulposus for intervertebral disc replacement〔J〕.Spine，2004;29(6):1290-8.

52 Hamilton DJ，Seguin CA，Wang J，et al.Formation of a nucleus pulposus-cartilage endplate construct in vitro〔J〕.Biomaterials，2006;27(1):397-405.

53 Fujita N，Miyamoto T，Imai J，et al.CD24 is expressed specifically in the nucleus pulposus of intervertebral discs〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;338:1890-6.

54 Lee CR，Sakai D，Nakai T，et al.A phenotypic comparison of intervertebral disc andarticular cartilage cells in the rat〔J〕.Eur Spine，2007;16:2174-85.

55 Rajpurohit R，Risbud MV，Ducheyne P，et al.Phenotypic characteristics of the nucleus pulposus:expression of hypoxia inducing factor-1，glucose transporter-1 and MMP-2〔J〕.Cell Tissue Res，2002;308:401-7.