DGGE技術在環境微生物多樣性研究中的應用

唐玉林

大連大學生命科學與技術學院 116622

近年來，隨著我國改革開放的不斷深入，我國經濟和科技都得到快速發展，并且人們的綜合素質水平也得到很大的提升，人們對環境保護的呼聲越來越高，且環境保護已經成為國際共同關注的重點話題。而微生物作為環境凈化的主要作用者之一，研究和開發新微生物處理技術以及新工藝具有重要的作用和意義。其主要是由于微生物能將有機物質作為營養源轉化為組成物質和能量，這些物質能有效吸附污染物，并且能有效降解環境中的污染源。DGGE技術是目前新技術研究的新產物，在環境生物多樣化研究中起著重要的作用，具有經濟的推廣意義。

1 DGGE技術分析

DGGE技術主要是利用具有化學變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠對DNA進行電脈，其主要是由于聚丙烯酰胺凝膠具有將PCR擴增產物有區分的分解開來。一般在使用聚丙烯酰胺凝膠對PDR產物進行變性梯度凝膠電脈分解時，由于長度相同而堿基序列上存在的DNA 雙鏈片段會隨著變性劑濃度的增加而在各自發生不同的變化，其空間結構形式也會發生變化。結構形式與濃度變化的關系為結構形式隨著濃度的增加而由開始雙鏈DNA向正極移動，DNA中含有低G+C的序列部分就會被拆解開來，但是高G+C含量的部分卻仍然保持雙鏈。在電脈過程中，DNA雙鏈一旦發生解鏈現象，DNA分子形成端部的就會被漸漸的熔化。如果電脈時，聚丙烯酰胺凝膠中的電脈急速下降，直至停止在其相應的不同的變性劑梯度位置時，染色后的DNA會被分開，并且以條狀的形狀出現，最終能將具有相同長度且有相互區別的DNA分子分離開來。

2 DGGE技術使用的基本工作流程

2.1 基本工作流程

首先，樣品預處理。DNA樣品提取是DGGE技術在環境微生物多樣化研究應用的前提和基礎。濕地樣品種類很多，這些細菌種類含有大量的有毒物質和腐殖質。而如何有效的提取DNA樣品直接決定著研究效果，一般DGGE技術取樣分為直接取樣法和間接取樣化。其中直接取樣法就是在土壤中直接裂解微生物體，然后從微生物中提取DNA，這種取樣法就是將微生物懸浮在裂解緩沖中處理，提取釋放的DNA，然后還要提煉，確保試驗樣品的純度。直接取樣有SDS高鹽提取法和SDS酚氯傷抽取法，前者的主要優勢在于提取效率高，而SDS酚氯抽提的效率比較低，并且會造成DNA分子不完整。但是SDS酚氯提取也有優勢，這種提取方法中含有的多腐殖酸等雜質，經過純化后就可以用于研究。另一種間接提取的方法就是將微生物細菌與土壤分開來，然后再提取DNA，這種方法提取的純度很高，片段完整，并且能直接用于后續一般的操作。間接提取方法比直接提取方法的效率要高，并且細胞分離的效果好。

其次，PCR的擴增及偏差和優化，這一個步驟是整個研究中最重要的部分，其主要采用16S DNA中的保護區作為引物進行PCR反應。采用16S DNA的重要原因是序列分子比較短，比較適應于分類學科的研究。再者，16S DNA是原核生物的主要成分，成分很穩定，在不同階段基因變化的情況比較小，表現得很保守。并且這種16S DNA都具有自身基本的資料庫，然后通過將提取的樣品預數據庫中的進行對比，最終得出結果。目前被廣泛應用到微生物多樣性研究中的16S DNA主要有338f/518r（V3區）以及341f/926r(V3-V5區)等。PCR技術的特點就是高溫變性、低溫退火以及常溫延伸等，這三個方面是主要使用的結構，主要是將特異耐熱酶TaqDNA中的聚合酶經過受熱發生反應，然后DNA分子會沿著模板方向延伸，將這個過程反復幾次，最終能使得DNA中的PCE擴增物的數目上升。一般在試驗中，的反映程序為：94!C/S、50!C/S以及72!C/S，一共有33個循環，最后就是延伸階段。從研究結果可以得知，在任何條件下試驗偏離最佳試驗條件將導致擴增PCR或者非特異性產物等，這些物質的產生很容易影響試驗結果和可靠性。所以，在實驗中一定要選擇最佳電泳條件。

最后，電泳條件的選擇在整合分析過程中是至關重要的部，因此，電泳條件的好壞直接關系著試驗研究的直接效果。一般的DGGE技術電泳條件包括變性劑梯度、電泳溫度以及時間和顯影等方面，這些方面的條件只要能達到相關標準，最終能通過反復的試驗確定結果。

3 DGGE技術在環境微生物多樣化研究中的應用

3.1 PCR-DGGE技術實現廢水電解

廢水處理主要是對廢水中的微生物群體解耦股的動態變化進行追蹤研究，針對兩種不同的微生物成分進行對比分析，最終得出理想的實際效果。即在相同條件下對低溫細菌種和常溫細菌種展開對比分析，觀察在不同技術下，常溫和低溫細菌的動態變化。根據相關實驗結果顯示，環境對微生物的影響直接決定著微生物群落結構的關鍵因子的組成結構。某單位利用DGGE技術對湖泊中中的污染的水源提取進行試驗，最終結果顯示在16S DNA中338f/518r（V3區）以及341f/926r(V3-V5區)PRC擴增，并且在V3區-V5區中存在很多微生物特異性片段，最終使用SDS間接提取的方法，對廢水中的微生物結構群進行比對研究，得出在不同階段和不同時間，微生物結構基本一致，但是優勢細菌卻不相同。由此說明，水解酸化池的活性污泥微生物多樣性受到水深度的影響變化很大，并且其結構也會發生種群散量上均有較大的差異。根據實驗結果顯示，DGGE技術在廢水處理中能凈化水中的污泥，講解廢水中的有害雜質，實現廢水再利用的理想效果。

3.2 PCR-DGGE技術在土壤微生物研究中的應用

通過運用PCR-DGGE對農田中的土壤微生物進行分析可知，DGGE技術可以對所取用的土壤微生物中不同微生物的16SrRNA基因片段上的V3區DNA擴增片斷進行分離。這一應用為DNA片段的鑒定與定性工作提供了良好條件。通過對南極中山站排污口土壤中微生物群落進行DGGE分析得到，該處樣品中的微生物組成與周圍環境中的微生物不太一樣。

3.3 PCR-DGGE技術在膜生物處理中的應用

PCR-DGGE技術可以用來解析膜生物反應器中的微生物，研究它們的群落多樣性，而這項技術在膜生物處理中的應用說明在長期的穩定運行以后，會形成各自的特定群落結構。這些群落結構既有優勢相同的種群同時也有具備自己獨特優勢的種群，并且同樣的種群在不同的反應器中所獲得的優勢也不相同，而種群所具備的獨特優勢則是在不同的水質中經過長時間的演變獲得的。利用PCRDGGE技術對生物陶粒反應器中細菌種群的巖體情況分析可知，優勢種群的數量與群落結構具有一定的時序動態性，并且微生物的多樣性與廢水的處理效果有著協同變化的特性。將生物膜和水體微生物之間多樣性進行比較以后發現，微生物膜越成熟，微生物群落越穩定，生物膜上面微生物的多樣性與水體微生物的多樣性相比就會越高。

4 DGGE技術在環境微生物多樣化研究中應用的優勢與未來展望

DGGE技術目前在實際使用中已經取得一定的成效，這種技術在微生物多樣化研究應用中的還無法達到最佳效果，如DGGE技術能將微生物中的DNA分解，達到有效降解環境中的污染物，起到保護環境的作用。但是，這種技術自身還存在一些缺點，如只能分解較小的片段，一般都是500bp以下的DNA分子，對于相對分子較大的片段就無法達到理想的效果。所以，技術研究人員不能停止研究腳步，還需要進一步針對當前DGGE技術使用中的難點進行研究和分析。最終找到解決方案，進一步提升技術水平，使之能更好的為環境保護作出貢獻，并且能被推廣應用到其他各個領域中，為構建社會主義和諧社會以及實現社會可持續發展做貢獻。尤其是隨著信息技術的不斷發展，未來DGGE技術在微生物多樣性研究中的應用要引進計算機技術的數據儲存、管理以及整理分子的功能，科學規范的對微生物中的分子進行分類鑒定，長久儲存鑒定數據資源，為以后研究人員提供豐富、大量的數據資源，進一步推進我國生物工程事業的發展。

結束語

綜上所述，目前DGGE技術在環境多樣化研究中已經得到廣泛的使用，主要有廢水處理、土壤生物研究以及膜生物處理研究等方面的應用，其在實際應用中已經得到良好的效果，能將微生物中具有相同長度且序列號有差異的DNA分解開來。使用DGGE技術進行環境微生物多樣化研究時，一般采用取樣分析法，通過直接過著間接取樣，對微生物中PCE擴增物進行優化，然后在最佳電泳的條件下，利用聚丙烯酰胺凝膠對DNA進行分解。通過反復試驗最終分解微生物中的DNA鏈，達到降解環境污染物的最佳效果，實現社會的可持續發展。

[1]張珍妮,吳曉芙,陳永華. DGGE技術在環境微生物多樣性研究中的應用[J]. 生物技術通報,2010(01)

[2]趙興青，楊柳燕，陳燦. PCR-DGGE技術用于湖泊沉積物中微生物群落結構多樣性研究[J]. 生態學科,2009(11)

[3]路盼盼.基于PCR-DGGE技術的新疆泥火山土壤真菌多樣性分析[D]. 石河子大學：生物化學與分子生物學,2011

[4]江云飛,蔡柏巖.PCR-DGGE技術在細菌多樣性研究中的條件優化[J].生物技術,2009(05)

[5]劉慧杰,楊彩云,田蘊等. 基于PCR-DGGE技術的紅樹林區微生物群落結構[J]. 微生物學報,2010(07)

[6]曹小妮. 克拉瑪依滲油與采油污染區細菌多樣性研究[J]. 石河子大學:生物化學與分子生物學,2009(11)

[7]焦雷.PCR-DGGE法在撫州市西湖水體微生物多樣性研究中的探討[J].內蒙古大學：環境工程,2010(11)

[8]吳進,胡國全,宋金龍. 基于mcrA克隆文庫和PCR-DGGE技術對牛糞為原料的農村戶用沼氣池產甲烷古菌的多樣性研究[J].中國沼氣,2012(03)

[9]劉晶晶,沈李東,胡寶蘭. Biolog和PCR-DGGE技術解析椒江口沉積物微生物多樣性[J]. 環境科學學科,2012(06)

[10]吳偉林,張秀霞,單寶來. PCR-DGGE技術用于石油污染土壤中微生物群落結構多樣性的初步研究[J]. 石油學報(石油加工),2010(04)