青蒿素的研究思路與啟示

杜婕瑩

青蒿素的研究思路與啟示

杜婕瑩

青蒿素是我國科研工作者首次從青蒿中分離鑒定得出的具有高效低毒的抗瘧特效藥，其產生發展及在治療瘧疾方面的出色表現對我國中藥事業具有深遠的影響，本文對青蒿素的研究思路進行了綜述，研究探討了青蒿素未來發展方向及新藥開發的啟示。

青蒿素；衍生物；藥理作用；生物合成；啟示

青蒿，又名黃花蒿（Artemisia Annu.L），是主要分布于我國廣西、云南、四川等地的菊科一年生草本植物。從黃花蒿中提取分離得到的有效成分——青蒿素（Artemisinin），是我國科研工作者首次從青蒿中分離鑒定得出的具有高效低毒的抗瘧特效藥[1]。在青蒿素的基礎上，又可合成多種衍生物，包括蒿甲醚（Artemether）、蒿乙醚（Artemotil）、青蒿琥酯（Artesunate）、雙氫青蒿素（Dihydroartemisinin, DHA）等。

瘧疾（Malaria）是一種在熱帶、亞熱帶地區由瘧原蟲（Plasmodium falciparum）所引發而廣泛傳播的寄生蟲病。據世界衛生組織（WHO）報告，瘧疾每年會導致3至5億人感染、一百多萬人死亡，其中大多數為孕婦和5歲以下的兒童[2]。因青蒿素本身的結構和代謝特點，在治療瘧疾方面有速效、高效、復燃率低和不易產生抗藥性等特征，受到WHO的青睞[3]。中國研發的蒿甲醚、青蒿琥酯和復方蒿甲醚已先后于1997、2002和2003年被WHO列入第9、11和12版基本藥物目錄（Essential Medicine List）。中藥是我國傳統醫學的瑰寶，青蒿素是唯一被WHO認可的中藥，也是僅有的兩個被收入世界藥典的中藥之一，其產生發展及在治療瘧疾方面的出色表現對我國中藥事業具有深遠的影響，本文對青蒿素的研究思路進行了綜述。

1 青蒿素的發現

國家科委和解放軍總后勤部于1967年5月23日召開“瘧疾防治藥物研究工作協作會議”，由此確立了由全國多部門參加的、以瘧疾防治藥物研究為任務，代號“523”的緊急軍工項目[4]。

青蒿素結構研究協作組從菊科植物黃花蒿中，分離出一種無色針狀結晶，定名為青蒿素，熔點156至157℃，其分子式為C15H22O5。根據光譜數據和X-射線分析及化學反應，證明其為一種新型的倍半萜內酯[5]。隨后，通過一系列化學反應、質譜、核磁共振譜和紅外光譜對其結構進行進一步的研究，證明青蒿素的確是含有一個過氧基團的化合物[6]。青蒿素具有兩個明顯的特征，一是含有雙烷基的過氧基團，并成為縮酮的一部分，而且它含過氧基團卻又相當穩定；另一特征是此過氧基團開始存在著氧-碳-氧-碳交替的鏈節，使分子的一側具備了連環套似的奇特結構[7]。青蒿素結構的特殊性，使得若按以前的經典方法難以判定其分子中的碳和氧原子究竟以何種方式相連成骨架，因而采用X-射線單晶衍射法，確定了構造和相對構型。最后于1978年由反常散射X-射線衍射法確定了青蒿素的絕對構型[8]。

2 青蒿素衍生物的合成

隨著青蒿素的發現及最初幾年來的臨床使用得出，其具有近期復發的缺點以及制劑上的一些問題。中國科學院上海藥物研究所抗瘧研究組對青蒿素進行了一系列的結構改造工作[9]。青蒿素是具有雙烷基過氧基團的倍半萜內酯，經氫化生成氫化青蒿素；與鈉硼氫反應可將內酯環上的羰基還原成羥基，得到還原青蒿素。通過抗瘧藥理研究，發現前者無抗瘧活性，后者的抗瘧活性則比青蒿素增強一倍。通過對構效關系的研究發現，過氧基團是青蒿素中抗瘧的主要有效基團，并從還原青蒿素出發合成了一系列的青蒿素衍生物。其中蒿甲醚、青蒿琥酯的合成解決了傳統抗瘧藥物抗藥性和青蒿素臨床應用的劑型問題，抗瘧活性也得到了提高。

隨著青蒿素及其衍生物在臨床上的廣泛應用，近十多年來，國內外學者開始了其對其它疾病治療作用的研究。研究發現，青蒿素及其衍生物具有更廣泛的藥理作用，如抗其它寄生蟲病[10-11]、抗癌[12-20]、免疫調節作用[21-24]和治療皮膚?。黄渲锌拱┘懊庖哒{節作用日益受到重視，研究也越來越深入。

3 青蒿素的合成

青蒿在世界各地均有分布，但青蒿素的含量卻與產地密切相關。在我國，北方產的青蒿中青蒿素的含量極低，其從南到北呈遞減趨勢。由于青蒿中青蒿素含量偏低，而隨著國際市場的開拓，野生資源已不能滿足世界范圍內對青蒿素原料的需求，植物性原材料緊張造成青蒿素短缺，同時提取環節復雜，費時費力，致使青蒿素的生產成本高，產量低，難以滿足市場需要[25]。

3.1 化學合成Schmil等[26]于1983年報道了應用關鍵化合物5（肛H），在低溫條件下通過光氧化反應引入過氧基團的全合成路線。Xu等[27]于1986年報道了青蒿素的全合成途徑。但由于青蒿素有多個手性碳原子，使得合成步驟非常復雜、產率低、成本高，從而很難應用于工業化生產[28]。

3.2 生物合成

3.2.1 組織培養可通過誘導出愈傷組織，然后由愈傷組織誘導出叢生芽，或者利用發根農桿菌感染整體植株或其某一器官、組織、單個細胞甚至原生質體后誘導出青蒿素含量較高的黃花蒿發根，這種方法是通過將Ri質粒上的T-DNA片段整合進植物細胞核基因組中誘導產生多分枝的不定根，通過質粒轉化的毛狀根生長迅速，遺傳特征和生理生化特性穩定，次級代謝產物合成能力強，有可能用于大規模工業化生產[29]。

3.2.2 轉基因克隆通過用攜帶外源基因的農桿菌感染健壯的黃花蒿植株，將外源基因插入到目標DNA的特定部位，然后對獲得的外源基因植株進行繼代培養，以得到性狀穩定的高產黃花蒿品系?；蛘卟捎媒M合生物合成法將不同生物體來原的基因組合在微生物體內生產出生物活性物質。Ro等[30]通過代謝工程獲得了153mg/L的紫穗槐-4,11-二烯和115mg/L的青蒿酸。

3.3 生物合成途徑青蒿素等倍半萜類的生物合成途經屬于植物類異戊二烯代謝途經中的甲羥戊酸途經（Mevalonic acid,MVA），該途徑在細胞質中進行。

3.3.1 青蒿素生物合成途經的關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR）催化羥甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA）形成MVA，由于MVA的形成是一個不可逆的過程，因此HMGR被認為是動物、植物、真菌和昆蟲類異戊二烯代謝途經的一個限速酶[31]。HMGR萜類化合物合成中的重要調控點，尤其是倍半萜類物質的合成HMGR活性呈正相關。

法呢基焦磷酸合酶基因（FPPS）催化異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）通過縮合作用形成GPP，GPP再與IPP縮合形成倍半萜、三萜和多萜的共同前體FPP。要提高青蒿素的產量，提高FPP的量至關重要，主要有兩種方式：方式一為導入與FPP合成相關的外源基因如HMGR、FPPS[32]；方式二為減少FPP流向萜類代謝的其它途經[33]。

紫穗槐-4,11-二烯合酶（ADS）為一種倍半萜合酶，FPP在ADS催化下發生自身環化生成青蒿素的第一個特異性前體物質紫穗槐-4,11-二烯[34]。紫穗槐-4,11-二烯含有一個烯丙基結構，很容易在紫穗槐-4,11-二烯P450單加氧酶作用下氧化生成相應的醇、醛和酸等化合物。

總的來說，青蒿素的合成首先由乙酰輔酶A經MVA途經生成FPP，然后FPP在ADS作用下環化生成紫穗槐-4,11-二烯，在P450的作用下紫穗槐-4,11-二烯氧化生成青蒿醇和青蒿醛，最后青蒿醛可能經過兩條獨立的氧化途經最后生成青蒿素。

3.3.2 從青蒿酸到青蒿素有觀點認為，青蒿酸首先還原生成二氫青蒿酸，再經過多步復雜的反應生成青蒿素。但隨著近年來的深入研究表明，青蒿素與二氫青蒿酸之間并沒有發生相互轉化[35]。紫穗槐-4,11-二烯P450單加氧酶編碼基因CYP71AV1催化紫穗槐-4,11-二烯氧化生成青蒿醇，繼而依次向青蒿醛和青蒿酸轉化。青蒿酸氧化途經為植物中青蒿素的主要生物合成途徑。

3.3.3 從二氫青蒿酸到青蒿素紫穗槐-4,11-二烯除了上述氧化途徑外，還存在另一條氧化途徑，即在CYP71AV1立體選擇催化下，紫穗槐-4,11-二烯羥基氧化生成青蒿醇，隨后向青蒿醛轉化，青蒿醛在還原酶作用下生成二氫青蒿醛，二氫青蒿醛在脫氫酶作用下進一步氧化生成二氫青蒿酸[36]。在體外模擬植物體內存在的光化學反應條件下，二氫青蒿酸可轉化成青蒿素，在反應的中間產物中檢測到二氫青蒿酸氫過氧化物，認為從二氫青蒿酸向青蒿素轉變的過程不需要酶的參與，在具光致敏性質化合物的激發下自發完成[37]。

4 啟示

從青蒿素的發現、衍生物的合成到其藥理作用、生物合成及作用機制的深入研究，青蒿素作為治療瘧疾的特效藥，在國內及國際上發揮著舉足輕重的作用，但要真正實現其工業化生產，以達到高產量、低成本的目的，仍有許多問題亟待解決。首先，雖然青蒿素的生物合成取得重大進展，但由青蒿酸向青蒿素的轉化還未能在微生物體內完成，該轉化所需相關蛋白酶的序列及相關基因的克隆與功能將成為日后的研究重點；其次，應優化植物基因在微生物體內的表達。由于外源基因或途徑導入宿主細胞后，宿主細胞內部嚴格的基因調控系統被破壞，導致基因表達和酶活性失去平衡，如何開發新的高效宿主-載體系統、有效平衡外源生物合成途徑值得深入探討；再次，利用微生物合成青蒿素，建立高效的菌株發酵和產品純化回收工藝同等重要；最后，青蒿素及其衍生物的抗腫瘤及免疫調節作用日益展現其光芒，應加強實驗及臨床研究，以開發新型抗腫瘤和免疫抑制藥物。

青蒿素研究的思路與過程及其取得的成就為傳統中藥現代化開發提供了指導性的典范作用，提高了中藥在世界上的地位。我國具有青蒿素類抗瘧藥的資源優勢，但因科技創新的欠缺、市場份額的制約和急功近利的心態使這種優勢轉化成弱勢。我國在對青蒿素類抗瘧藥研發的同時，應加強國際化運作方式，為青蒿素新一輪的博弈，甚至下一個“青蒿素”的研發與國際化做好準備，打好堅實的基礎。從而使傳統中藥走向產業化、現代化、國際化，以充分發揮其經濟效益和社會效益。

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Research Ideas and Revelation in Studies on Artemisinin

Du Jie ying

Artesunate is the high-efficiency and low-toxicity anti-malaria drugs that separated and identified from China’ s scientific researchers for the first time.Its emergence and development and the excellent performance in the treatment of malaria have a far-reaching influence for traditional Chinese medicine. This paper summarized the research ideas of artesunate and revelated its future development direction and new drug exploitation.

Artesunate; Derivative; Pharmacologic actions; Biosynthesis; Revelation

R2-03

B

1673-5846(2013)04-0058-04

廣州市婦女兒童醫療中心中藥科，廣東廣州 510623