過氧化損傷及抗氧化能力時間動態變化與造血干/祖細胞衰老的相關性

耿 珊 張 琛 徐春燕 姜 蓉 王 璐 王建偉 王亞平

(重慶醫科大學干細胞與組織工程研究室組織胚胎學教研室，重慶 400016)

過氧化損傷及抗氧化能力時間動態變化與造血干/祖細胞衰老的相關性

耿 珊 張 琛 徐春燕 姜 蓉 王 璐 王建偉 王亞平

(重慶醫科大學干細胞與組織工程研究室組織胚胎學教研室，重慶 400016)

目的探討增齡過程中小鼠Sca-1+造血干/祖細胞(Sca-1+HSC/HPC)過氧化損傷及抗氧化能力的動態變化與其衰老的關系。方法

C57BL/6J雄性小鼠分為幼年組(3～4周齡)，青年組(2月齡)，中年組(6月齡)，中老年組(12月齡)，老年組(18月齡)。提取各組小鼠骨髓單個核細胞，免疫磁性吸附細胞分選法(MACS)分離純化Sca-1+細胞群，WST法檢測細胞超氧化物歧化酶(SOD)含量，TNB顯色法檢測細胞總谷胱甘肽(GSSG+GSH)含量，WST-1法檢測超氧化物含量，硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA)含量，衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色觀察各年齡組陽性細胞百分比，造血祖細胞混合集落培養比較各年齡組Sca-1+細胞形成集落能力。結果總SOD活力值、GSSG+GSH含量、超氧化物含量吸光度、MDA含量、SA-β-Gal陽性細胞百分比及混合集落形成率分別在幼年組為(27.51±1.11)U/g、(28.78±0.77)μmol/L、(0.114±0.005)、(2.06±0.54)nmol/mg、(2.26±0.65)%、(8.79±0.56);青年組為(38.23±3.50)U/g、(31.48 ±2.03)μmol/L、(0.109±0.005)、(0.81 ±0.35)nmol/mg、(9.08±2.74)%、(9.48±0.74);中年組為(28.85±0.65)U/g、(47.62±4.93)μmol/L、(0.133±0.002)、(2.69±0.62)nmol/mg、(11.58±0.89)%、(5.14 ±0.89);中老年組(12.67±0.89)U/g、(25.63±1.23)μmol/L、(0.151±0.009)、(11.44±1.19)nmol/mg、(35.34±2.50)%、(1.56±0.23);老年組為(17.52±1.27)U/g、(39.10±2.19)μmol/L、(0.141±0.005)、(7.06±0.95)nmol/mg、(15.76±1.23)%、(0.98±0.50)。結論隨年齡增加Sca-1+HSC/HPC的SA-β-Gal陽性細胞百分比逐漸增高，混合集落形成能力下降，SOD活性、GSSG+GSH含量逐步降低，而超氧化物、MDA含量逐漸增加，提示在增齡過程Sca-1+HSC/HPC過氧化損傷，抗氧化能力逐漸降低是造血干細胞衰老的可能機制之一。

Sca-1+造血干/祖細胞;超氧化物歧化酶;谷胱甘肽;超氧化物;丙二醛

氧化損傷理論被認為是細胞衰老的重要機制之一，該理論認為機體內具有完善產生和清除氧自由基的平衡體系〔1〕。由于細胞生存環境中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)等機體抗氧化酶的活性不斷下降，使得細胞內氧自由基蓄積，細胞逐漸受到損失并最終發生衰老〔2〕。造血干細胞具有高度的自我更新、多向分化、跨系分化與重建長期造血的潛能，盡管在機體衰老在過程中造血系統的基本成分得以維持，但造血干細胞的數量和功能逐漸降低〔3〕。本研究采用免疫磁性吸附細胞分選法分離純化不同年齡小鼠的Sca-1+造血干/祖細胞(Sca-1+HSC/HPC)，研究氧化損傷與抗損傷因素在造血干細胞自然衰老中的作用，為闡述在增齡過程中HSC/HPC衰老機制提供理論與實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 雄性C57BL/6小鼠，重慶市醫學實驗動物中心提供〔動物合格證號:SCXK(渝)2007-0001〕。小鼠分為幼年組(3～4周齡，質量13～16 g)，青年組(2月齡，質量20～25 g)，中年組(6月齡，質量35～40 g)，中老年組(12月齡，質量39～43 g)，老年組(18月齡，質量37～45 g)。

1.2 主要藥品與試劑 抗Sca-1+微珠試劑盒(No.130-092-529)，MiniMACS磁珠分選系統，MS磁珠分離柱，緩沖液(德國Miltenyi Biotech公司);總谷胱甘肽檢測試劑盒(S0052)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型P0010S)，超氧化物檢測試劑盒(S0060)，總SOD活性檢測試劑盒(WST法S0102)，脂質氧化(MDA)檢測試劑盒(S0131)，Western及 IP細胞裂解液(P0013)，細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(C0602)，小鼠干細胞集落形成實驗專用混合培養基(美國Stem cell公司)，紅細胞裂解液(碧云天生物技術有限公司)。

1.3 免疫磁珠分離純化Sca-1+造血干/祖細胞〔4〕頸椎脫臼處死各年齡組小鼠，取脛骨和股骨，分離提取骨髓單個核細胞。按本課題組方法，采用免疫磁性細胞分選系統(MACS)分離、純化Sca-1+造血干/祖細胞(Sca-1+HSC/HPC)，并進行細胞活性和純度鑒定。

1.4 WST法檢測各組Sca-1+細胞總SOD活性 收集分選的各年齡組 Sca-1+細胞(每組1×106個)，PBS洗滌 2次，加Western及IP細胞裂解液充分裂解細胞，離心5 min。取上清，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照總SOD活性檢測試劑盒說明加樣，450 nm波長測定吸光度，根據說明書計算出各年齡組的Sca-1+HSC/HPC每克蛋白SOD酶活力單位。

1.5 TNB顯色法檢測各組Sca-1+細胞總谷胱甘肽含量 收集分選的各年齡組Sca-1+細胞(每組1×106個)，PBS洗滌細胞1次，離心收集細胞，吸盡上清。按照總谷胱甘肽檢測試劑盒操作，獲得樣品在412波長測定吸光度值。根據不同濃度標準品測得的不同吸光度作出標準曲線，根據標準曲線計算出各組總谷胱甘肽的含量。

1.6 WST-1法檢測各組Sca-1+細胞超氧化物含量 按超氧化物檢測試劑盒說明書配制檢測工作液。收集分選的各年齡組Sca-1+細胞(每組5×104個/m l)，PBS洗滌1次，在96孔板中每孔加入200μl檢測工作液懸浮的細胞37℃孵育3 min，Biorad 550酶標儀(美國伯樂公司)在450 nm測定吸光度。

1.7 硫代巴比妥酸(TBA)法檢測各組Sca-1+細胞MDA含量收集分選的各年齡組Sca-1+細胞(每組1×106個)，按脂質氧化(MDA)檢測試劑盒說明書配制檢測工作液，取細胞樣品加入到96孔板中，在532 nm測定吸光度。根據標準曲線計算獲得MDA的摩爾濃度，計算出樣品溶液中的MDA含量，通過單位重量的蛋白含量來表示最初樣品中的MDA含量。

1.8 衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色 分別收集各年齡組Sca-1+HSC/HPC各1×105個，按照SA-β-gal Staining Kit試劑盒方法對各組Sca-1+HSC/HPC進行染色。染色陽性細胞呈藍色，倒置相差顯微鏡下觀察200個細胞，計數陽性細胞百分率。

1.9 各年齡組Sca-1+細胞形成造血祖細胞集落能力比較 分別取各年齡組Sca-1+細胞各4×104個細胞，加入1 ml混合集落專用培養基，混勻后分別加入24孔細胞培養板0.5 m l/孔，每天用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態并拍照，培養7 d時計數各組混合集落數。

1.10 統計學分析 采用SPSS17.0軟件分析，數據以±s表示，描繪各年齡組小鼠Sca-1+HSC/HPC的SOD、總谷胱甘肽、超氧化物及MDA含量變化曲線，方差分析比較不同年齡組各指標差異，相關分析比較各檢測指標與年齡變化有無相關性。

2 結果

2.1 MACS分選前后Sca-1+細胞純度比較 MACS分選前Sca-1+細胞百分比為(1.02±0.19)%;MACS分離純化后Sca-1+細胞純度可達(93.66±0.83)%。各年齡組分選前后Sca-1+細胞純度百分比無統計學差別(P＞0.05)(表1)。

表1 各年齡組分選前后Sca-1+細胞純度百分比(%，±s)

表1 各年齡組分選前后Sca-1+細胞純度百分比(%，±s)

組別 n 分選前Sca-1+細胞純度 分選后Sca-1+10 0.89±0.56 93.06±0.65青年組 10 1.08±0.74 93.26±0.89中年組 10 1.14±0.89 94.85±0.77中老年組 10 1.76±0.23 94.23±0.45老年組 10 0.98±0.50 93.76±0.321)細胞純度幼年組

2.2 各年齡組Sca-1+細胞內總SOD活性 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組各組樣品總SOD活力值分別為(27.51±1.11)、(38.23 ±3.50)、(28.85 ±0.65)、(17.52 ±1.27)、(12.67±0.89)U/g。總SOD活性與月齡變化有明顯相關關系(r2=0.881 9，P ＜0.01)。

2.3 各年齡組Sca-1+細胞內總谷胱甘肽含量 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組各組總谷胱甘肽的含量分別為(28.78±0.77)、(31.48 ±2.03)、(47.62 ±4.93)、(39.10 ±2.19)、(25.63±1.23)μmol/L。GSH含量變化與月齡變化有明顯相關關系(r2=0.875 4，P＜0.01)。

2.4 各年齡組Sca-1+細胞內細胞超氧化物含量 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組各組測得吸光度分別為(0.114±0.005)、(0.109±0.005)、(0.133±0.002)、(0.141 ±0.005)、(0.151±0.009)。超氧化物含量反映的吸光度變化與月齡變化有明顯相關關系(r2=0.946 4，P＜0.05)。

2.5 各年齡組Sca-1+細胞內MDA含量 幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組測得各組Sca-1+細胞MDA含量分別為(2.06±0.54)、(0.81±0.35)、(2.69±0.62)、(7.06±0.95)、(11.44±1.19)nmol/mg。MDA含量含量變化與月齡變化有明顯正相關關系(r2=0.955 2，P＜0.01)。

2.6 各年齡組Sca-1+細胞SA-β-Gal陽性細胞百分比 SA-β-半乳糖苷酶染色顯示陽性細胞著藍色，胞漿內可見藍色顆粒;陰性細胞未著色。幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組的陽性細胞數逐漸升高，分別為(2.26±0.65)%、(9.08±2.74)%、(11.58±0.89)%、(15.76±1.23)%、(35.34±2.50)，各年齡組之間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.7 各年齡組Sca-1+細胞形成造血祖細胞集落能力比較 通過觀察得知幼年組、青年組、中年組、中老年組和老年組的Sca-1+細胞形成的造血祖細胞集落數量降低，集落中細胞數也逐漸減少，分別為(8.79±0.56)、(9.48±0.74)、(5.14±0.89)、(1.56±0.23)、(0.98±0.50)個/104，各年齡組之間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

理論上認為3～4周齡小鼠各器官發育水平相當于人類1～2歲即幼年水平，2月齡小鼠相當于15～20歲即青壯年水平，6月齡小鼠相當于40～50歲即中年水平，12月齡小鼠相當于60歲左右即中老年水平，18月齡小鼠相當于70歲以上即進入老年水平。

造血干細胞損傷衰老后，其自我更新和多向分化的能力下降，表現為造血干細胞數量減低，增殖分化形成造血祖細胞的能力下降，后者進一步分化形成各系成熟血細胞功能衰退，表現為外周血全血細胞下降，骨髓明顯收抑制，發生再生障礙性貧血。研究證明，造血干細胞衰老與老年性白血病有密切聯系，隨年齡增長，老年人急性髓性白血病(AML)逐年增高〔5〕。

SOD能催化超氧化物陰離子發生歧化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內一種重要的抗氧化酶。SOD活性通常有種屬、性別及組織特異性，不同動物的不同器官隨年齡增長，SOD活性各不同〔6〕。本研究發現隨年齡增長造血干細胞中的SOD呈下降趨勢，整個生命中總體變化趨勢，自出生至青年達到高峰，之后出現緩慢降低，其趨勢與造血干細胞形成發展及衰老趨勢相一致，表明中年起造血干細胞抗氧化能力急劇下降與其衰老相關。

還原型谷胱甘肽是絕大多數活細胞中巰基的主要來源，對于維護蛋白巰基適當的氧化還原狀態有重要作用，并且是動物細胞中關鍵的抗氧化劑。本研究發現隨年齡增長總谷胱甘肽呈下降趨勢，整個生命中總體變化趨勢，自出生至中年達到高峰，之后出現緩慢降低，其下降趨勢與造血干細胞形成及發展趨勢相一致，再次表明中老年起始造血干細胞抗氧化能力急劇下降與其衰老相關。

超氧化物通常指超氧化物陰離子O2－，是一種氧分子的自由基。在呼吸鏈中，NADPH氧化酶把電子傳遞給氧分子的時候，就會產生超氧化物陰離子O2－。超氧化物陰離子O2－是一種強氧化劑，可以由被刺激的白細胞等產生，從而抵御微生物的感染等。超氧化物陰離子O2－也可以導致氧化損傷，和許多疾病的發生密切相關。本研究發現隨年齡增長超氧化物呈上升趨勢，整個生命中總體變化趨勢，自出生至青年達到最低，可能是由于這一時期抗氧化能力比較強，之后出現緩慢增長，其趨勢表明中年起造血干細胞過氧化損傷急劇增高與其衰老相關。

MDA是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化作用所形成的脂質過氧化物。MDA的量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映細胞損傷的程度。脂質過氧化產物又可進一步引起細胞損傷，主要因素有:①膜脂改變導致膜功能障礙和膜酶的損傷;②活性氧造成脂質過氧化過程中產生的活性產物對酶和其他細胞成分的損傷〔7〕。本次實驗觀察到小鼠造血干細胞MDA含量自出生后1～2個月處于低水平，2～6個月基本穩定，自6個月開始急劇上升，表明造血干細胞脂質氧化損傷嬰幼兒、少年、青中年程度大致相當，自中年起始氧化損傷進行性急劇加重。

絕大多數正常細胞被認為僅有有限的分裂能力，在不能分裂后就進入衰老狀態。此時細胞仍然是存活的，但細胞的基因和蛋白的表達譜發生了很大改變。衰老細胞細胞通常體積變大，表達pH 6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶。本次實驗觀察到隨年齡增長小鼠造血干細胞β-半乳糖苷酶活性逐漸增高，集落形成能力逐漸降低，說明造血干細胞逐漸出現衰老且功能逐漸出現下降。

綜合分析上述4項指標變化趨勢可以推測，隨著年齡增長，造血干細胞在長期紫外線照射、維生素缺乏、微量元素代謝紊亂、內分泌影響、離子輻射等危險因素作用下，自中年起始抗氧化能力急劇下降，導致氧化及抗氧化平衡關系被打破，造血干細胞氧化損傷開始急劇加重，這可能是導致造血干細胞出現衰老，導致老年性白血病和再生障礙性貧血的發病率增高。

1 王亞平.造血干細胞生物學及其研究方法〔M〕.北京:科學出版社，2007:322-6.

2 Zhou Y，Yang B，Yao X，etal.Establishmentofan agingmodel of Sca-1+hematopoietic stem cell and studies on its relative biologicalmechanisms〔J〕.In Vitro Cell Dev Biol Animal，2010;47(2):149-53.

3 Lagasse E.Purified hematopoietic stem cells can differentiate to hepatocytes in vivo〔J〕.Nature Med，2000;6(11):1229-34.

4 耿 珊，張 琛，劉 俊，等.免疫磁性活化細胞分選方法優化及純化后細胞的生物學特性檢測〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2012;28(7):393-4.

5 王亞平.干細胞衰老與疾病〔M〕.北京:科學出版社，2009:13-4.

6 Warner HR.Superoxide dismutase，aging and degenerative disease〔J〕.Free R ad ic Biol Med，1994;17(3):249-58.

7 Yan Lu，ZHao Ke-Hao，Li L，etal.Lipid peroxidation and antioxidation in lens of aging rats〔J〕.Rec Adv Ophthalmol，2008;28(4):241-4.

The dynam ic changes of peroxidation and antioxidation in hematopoietic stem/progenitor cells aging

GENG Shan，ZHANG Chen，XU Chun-Yan，et al.
Laboratory of Stem Cells and Tissue Engineering，Department of Histology and Embryology，Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

ObjectiveTo investigate the dynamic changes of peroxidation and antioxidation in Sca-1+hemopoietic stem/progenitor cells of agingmice.MethodsSixty C57BL/6Jmice were divided into 3 ～4 weeks，2，6，12，18 months group，20 mice in 3 ～4 weeks group，10 mice in others.Themice were executed to wash out bone marrow.The MACSwas applied to obtain the Sca-1+hematopoietic stem/progenitor cells from mouse bonemarrow respectively.The TNB colour test，WST-1 method and thiobarbituric acidmethodswere used to detect total glutathione(GSSG+GSH)，superoxide dismutase(SOD)，superoxide and malondialdehyde(MDA)levels in the Sca-1+hematopoietic stem/progenitor cells of thesemice.The percentage of SA-β-gal positive cellswas detected by senescence-associated β-galactosidase(SA-β-Gal)staining.The ability to forming CFU-Mix was tested.ResultsThe SOD contents of Sca-1+HSC/HPC in five groups were(27.51±1.11)，(38.23±3.50)，(28.85±0.65)，(12.67±0.89)，(17.52±1.27)U/g(P＜0.01).The total glutathione contents were(28.78±0.77)，(31.48±2.03)，(47.62±4.93)，(25.63±1.23)，(39.10±2.19)μmol/L(P ＜0.01).The optical density reflected by superoxide contentswere(0.114±0.005)，(0.109±0.005)，(0.133±0.002)，(0.151±0.009)，(0.141±0.005)(P＜0.01).The MDA contents were(2.06±0.54)，(0.81±0.35)，(2.69±0.62)，(11.44±1.19)，(7.06±0.95)nmol/mg(P＜0.01).The percentages of SA-β-gal positive cells were(2.26±0.65)%，(9.08±2.74)%，(11.58±0.89)%，(35.34±2.50)%，(15.76±1.23)%.The numbers of CFU-Mix were(8.79±0.56)，(9.48±0.74)，(5.14±0.89)，(1.56±0.23)，(0.98±0.50).ConclusionsWith aging，the contents of total glutathione and SOD are decreased，the contents of superoxide and MDA are increased，which indicates that the aging procedure is related with increase of peroxidation damage and the descent of antioxidation ability in Sca-1+hematopoietic stem/progenitor cells.

Sca-1+HSC/HPC;Superoxide dismutase;Glutathione;Superoxide;Malondialdehyde

R329.2

A

1005-9202(2013)05-1061-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.035

國家自然科學基金課題資助(81173398，30973818，30970872)

王亞平(1956-)，男，教授，主要從事干細胞衰老研究。

耿 珊(1986-)，女，在讀碩士，主要從事造血干細胞衰老的研究。

〔2012-11-05收稿 2013-02-20修回〕

(編輯 曲 莉)