白藜蘆醇通過核因子-κB信號通路抑制腦缺血基質金屬蛋白酶功能上調

朱佳蕾 鄧夏珩 高 麗 顧 昊 沈 偉 郭 軍

(南京醫科大學基礎醫學實驗教學中心，江蘇 南京 210029)

白藜蘆醇通過核因子-κB信號通路抑制腦缺血基質金屬蛋白酶功能上調

朱佳蕾 鄧夏珩 高 麗1顧 昊1沈 偉1郭 軍2

(南京醫科大學基礎醫學實驗教學中心，江蘇 南京 210029)

目的揭示白藜蘆醇抑制腦缺血基質金屬蛋白酶(MMP)-9功能上調的分子機制及其與核因子(NF)-κB信號通路聯系。方法建立大鼠四動脈前腦缺血模型，采用免疫印跡技術觀察缺血后再灌海馬腦區MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位的變化;給予自由基清除劑白藜蘆醇或NF-κB抑制劑吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)，識別NF-κB信號通路是否參與了白藜蘆醇對腦缺血MMP-9蛋白表達的調控。結果腦缺血/再灌誘導海馬腦區MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位增加(P＜0.05)。PDTC能一定程度的抑制缺血后MMP-9基因表達(P＜0.05)。白藜蘆醇能顯著抑制腦缺血NF-κB核易位和MMP-9表達上調(P＜0.05)。結論腦缺血再灌，誘導MMP-9依賴NF-κB通路的蛋白水平增加，白藜蘆醇能通過抑制NF-κB通路下調MMP-9的功能，繼而阻斷MMP-9激活介導的胞外基質降解及海馬腦區損傷。

腦缺血;白藜蘆醇;MMP-9;NF-κB

基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組活性依賴鈣離子和鋅離子的中性蛋白酶家族，在體內組成性表達，參與降解各種細胞外基質(ECM)〔1〕。現已識別20多種蛋白，其中MMP-9是MMPs家族的主要成員之一。通過誘導胞外基質異常降解，MMP-9參與了多種神經性疾病的發生，如髓鞘脫失、血腦屏障損傷等，而MMP-9在缺血性腦損傷的精確分子調控機制有待探明。有研究表明:MMP-9的表達上調及功能異常與自由基產生密切相關，且其啟動序列具有因子(NF)-κB的識別位點。因而，本研究擬采用具有自由基清除功能的白藜蘆醇及NF-κB抑制劑，檢測腦缺血后海馬腦區自由基生成及NF-κB信號通路對MMP-9基因表達及功能上調的影響，繼而揭示天然化合物白藜蘆醇能通過NF-κB信號通路抑制MMP-9，阻斷缺血后胞外基質降解，保護海馬神經細胞的分子機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康成年雄性SD大鼠來自南京醫科大學實驗動物中心，體重220～250 g，室溫下飼養。

1.2 抗體 MMP-9和β-actin抗體來源于武漢博士德生物工程有限公司;NF-κB抗體是Cell Signaling Technology公司產品。

1.3 其他試劑 白藜蘆醇購自南京澤朗醫藥科技有限公司;吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)來源于碧云天生物技術研究所，是國外分裝產品。

1.4 方法

1.4.1 前腦缺血模型 采用四動脈阻斷法建立前腦缺血模型〔2〕，實驗操作過程符合南京醫科大學實驗動物使用規定。水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠;俯臥位固定大鼠，暴露第2頸椎，電灼兩側椎動脈，造成永久性閉塞;腹側頸正中切口并分離頸總動脈，絲線標記;電灼24 h后，動脈夾夾住雙側頸總動脈，使大鼠腦部供血完全阻斷;10 min后松開動脈夾，再灌注12和24 h。該過程要求大鼠在動脈充分阻斷時須滿足下列條件:(1)腦電波完全平坦，(2)瞳孔擴張，(3)無角膜反射，(4)直腸溫度穩定(約37℃)。對照組大鼠進行相似的外科手術但無動脈阻斷。藥物注射實驗組，腹腔注射自由基清除劑白藜蘆醇(200 mg/kg)或相同劑量的生理鹽水。每組動物接受相同的手術準備和操作方式，以減少手術過程造成的誤差。

1.4.2 腦室注射 大鼠經乙醚麻醉后固定于腦立體定位儀上，使顱骨保持水平位置，用過氧化氫灼燒暴露前囟點。然后用直徑1.5 mm的鉆頭鉆孔，位置為:前自后0.8 mm，旁開1.5 mm，深3.5 mm。利用微量注射器通過單側腦室注射吡咯二硫氨基甲酸酯(100 mmol/L，4μl)。

1.4.3 各亞細胞組分的分離和蛋白樣本制備 大鼠斷頭取腦，快速分離海馬，并置于1∶10(W/V)的冰冷勻漿液(HEPES 50，pH 7.4，KCl 100，Na3VO41，NaF 50，PMSF 1 mmol/L)中，勻漿器高速破碎組織。4℃低溫離心10 min取上清，為胞質和胞膜組分，沉淀為胞核。加勻漿液懸浮胞核沉淀，超聲破碎，離心10 min，取上清為胞核成分。Bradford法測定蛋白含量并將組織樣本調為等量蛋白濃度，置－80℃保存或直接100℃ ×5 min變性蛋白樣本。

1.4.4 電泳與免疫印跡分析 采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，并轉移至硝化纖維素膜(NC)。3%牛血清白蛋白(BSA)封閉2 h，室溫下一抗孵育4 h，接著TBST洗膜，加入相應酶標二抗辣根過氧化物酶(HRP)結合羊抗兔或抗鼠IgG(1∶10 000)，室溫反應2 h，洗膜后，滴加顯色劑，暗室膠片曝光。

2 結果

2.1 腦缺血/再灌誘導海馬腦區MMP-9蛋白水平變化 為了檢測缺血/再灌大鼠海馬腦區 MMP-9蛋白水平變化，采用MMP-9和抗體檢測了MMP-9和β-actin蛋白含量變化。免疫印跡結果表明:前腦缺血再灌24 h，能誘導pro-MMP-9蛋白含量顯著上調(P＜0.05)，為空白對照組的2.45倍，而β-actin蛋白水平基本保持穩定。提示前腦缺血誘導海馬腦區MMP-9蛋白含量增加，其功能上調與缺血性腦損傷密切聯系，見圖1。

2.2 腦缺血/再灌海馬腦區NF-κB核易位變化 為評價腦缺血后核轉錄因子NF-κB對MMP-9基因表達的潛在機制，采用差速離心結合免疫印跡技術觀察了不同亞細胞組分NF-κB及β-actin蛋白水平變化。結果表明腦缺血再灌12 h能誘導NF-κB胞漿蛋白含量減少(5.88%，P＜0.05)，胞核蛋白顯著增加(429.4%，P＜0.05)，而總蛋白水平基本保持不變(113.2%，P＞0.05)，同時β-actin總蛋白水平基本穩定。提示前腦缺血誘導NF-κB核易位增加和功能上調，可能參與了缺血后腦組織基因表達調節。見圖2。

2.3 NF-κB信號通路對腦缺血后pro-MMP-9蛋白水平的調節為了證實NF-κB信號通路參與了MMP-9基因表達調控，采用腦室注射NF-κB抑制劑PDTC，抑制NF-κB信號通路。PDTC能有效下調缺血/再灌海馬腦區MMP-9蛋白表達增加，與溶劑組比降低了17.5%，兩者差異顯著(P＜0.05)。提示缺血誘導的NF-κB激活參與了MMP-9基因表達調控，是其蛋白水平增加及功能上調的重要分子機制。見圖3。

圖1 免疫印跡檢測腦缺血再灌海馬組織pro-MMP-9蛋白含量變化

圖2 W estern印跡結合亞細胞分離實驗評價腦缺血再灌海馬組織NF-κB蛋白水平變化

圖3 免疫印跡結合藥理學實驗分析腦缺血再灌NF-κB抑制劑(PDTC)對pro-MMP-9蛋白水平的影響

2.4 白藜蘆醇對腦缺血后NF-κB核易位和MMP-9表達的影響 為了闡明自由基清除對腦缺血NF-κB功能及MMP-9蛋白水平的影響，腹腔注射白藜蘆醇。免疫印跡檢測表明:白藜蘆醇能顯著性抑制缺血后NF-κB胞漿含量減少和MMP-9蛋白水平增加(80.39%，156.9%)，與溶劑組比有顯著差異(23.53%，264.7%，P＜0.05)。提示腦缺血誘導NF-κB功能上調及其介導的MMP-9基因表達與自由基生成有密切聯系，白藜蘆醇通過抑制NF-κB通路，下調MMP-9胞外基質降解功能，減弱腦缺血后神經損傷。見圖4。

圖4 白藜蘆醇對腦缺血后NF-κB核易位和MMP-9表達的影響

3 討論

有研究表明〔3〕:白藜蘆醇能清除超氧陰離子、NO、羥基自由基等，減少H2O2產生，顯著抑制氧化性指標丙二醛(MDA)、乳酸(LD)含量增加，恢復超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱苷肽(GSH)水平，從而減少腦梗死和水腫體積，發揮氧自由基清除劑的保護功效〔4，5〕。也有學者認為白藜蘆醇對腦缺血后的神經保護作用與其抗炎功效、雌激素活性、調節多種神經遞質和神經調質的釋放等有關〔6～11〕。本研究揭示，白藜蘆醇能通過抑制NF-κB核易位，下調腦缺血MMP-9蛋白水平，阻斷MMP-9介導的細胞外基質降解和血腦屏障損傷，繼而發揮相關神經保護功能。

MMP-9是MMPs家族中分子量最大的酶。近年越來越多的證據表明:激活的MMP-9能降解血管周圍基膜主要成分Ⅳ、Ⅴ型明膠膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白〔12〕，觸發組織繼發性損傷。MMP-9被確認能定位于腦內神經元、膠質細胞及血管內皮細胞。腦缺血后，MMP9含量增加，可降解細胞外基質成分，破壞神經細胞間的聯系和血腦屏障〔13，14〕，繼而導致炎性細胞(中性粒細胞、巨噬細胞)侵入腦組織，誘導繼發性炎癥反應。同時血腦屏障的破壞也促進了毛細血管內水分和血漿蛋白的外滲，造成血管源性腦組織水腫〔15〕;兩者共同觸發腦組織廣泛損傷，成為腦內神經功能喪失的重要誘因。

MMP-9的基因表達受多種因素調控，其中其基因啟動序列－670～ －599，被識別是 NF-κB p65結合位點，能誘導 MMP-9基因轉錄起始〔12〕。腫瘤細胞侵襲實驗發現:NF-κB的高度激活伴隨MMP-9的高表達，是細胞外基質降解的重要調控機制〔16，17〕。本研究證實，腦缺血再灌能刺激 NF-κBp65 的核轉位增加，且抑制NF-κB功能能顯著抑制缺血后MMP-9蛋白水平。因而，作為核轉錄因子，NF-κBp65參與了腦缺血MMP-9基因表達調控，密切聯系海馬腦區組織損傷。

綜上所述，白藜蘆醇作為自由基清除劑，能通過抑制腦缺血誘導的NF-κB核轉位，繼而下調MMP-9基因表達和功能上調，阻止缺血后MMP-9對胞外基質的降解，穩定腦組織內環境，降低腦神經元損傷，發揮生物學保護功能。本研究闡明了腦缺血神經損傷的分子機制及白藜蘆醇阻止神經損傷的新途徑，能為臨床治療缺血性腦卒中提供有益的啟示。

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Effect of resveratrol on NF-κB-induced upregulation of MMP-9 function follow ing cerebral ischem ia

ZHU Jia-Lei，DENG Xia-Heng，GAO Li，et al.
Laboratory Center for Basic M edical Sciences，Nanjing M edical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China

ObjectiveTo explore themolecularmechanisms underlying inhibiting MMP-9 function increasing resulted from cerebral ischemia by resveratrol and its relationswith NF-κB signaling pathway.MethodsFour arterial forebrain ischemiamodel of ratswere established and the changes of MMP-9 protein and NF-κB nuclear transfer were observed by adopting immunoblot assay after ischemia reperfusion in hippocampus.ResultsAfter ischemia reperfusion was adopted，MMP-9 protein level in hippocampus and NF-κB nuclear transfer were induced to increase.PDTC inhibited the increasing of MMP-9 expression to a certain degree after ischemia reperfusion.Resveratrol significantly inhibited NF-κB nuclear transfer and MMP-9 expression after ischemia reperfusion.ConclusionsMMP-9 expression depends on NF-κB pathway is increased as induced by reperfusion after cerebral ischemia.Resveratrol can inhibit the function of MMP-9 through NF-κB pathway，therefore blocking the extracellularmatrix degradation and the damage to the hippocampus areawhich is resulted from the activation of MMP-9.

Cerebral ischemia;Resveratrol;MMP-9;NF-κB

R34

A

1005-9202(2013)05-1073-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.05.040

國家自然科學基金(81170714);南京市科技發展計劃科研項目(200901081)

1 南京醫科大學附屬腦科醫院

2 南京醫科大學生物化學與分子生物學系

沈 偉(1971-)，男，副主任醫師，博士，碩士生導師，主要從事退行性神經病變研究。

朱佳蕾(1989-)，女，在讀本科，主要從事神經退行性疾病藥理學研究。

〔2011-11-18收稿 2012-03-14修回〕

(編輯 曹夢園)