表面增強拉曼散射標記免疫檢測的再生性研究

祁妍華

拉曼光譜是在分子水平上研究物質結構的一種重要的工具，已廣泛應用于分析科學領域[1]，表面增強拉曼光譜克服了普通拉曼光譜檢測靈敏度低的缺點[2]，是靈敏度較高的研究界面效應的技術之一，能最大限度地應用于研究吸附分子在表面的取向及吸附行為、吸附界面表面狀態、生物大分子的界面取向及構型、構象和結構分析[3]。在商品化的實際應用中，需要強調產品的可再生利用性，需采用真正可行的抗體抗原分離方式，同時不影響抗體抗原的活性與特異性[4]。

在以上理論的基礎上，本實驗在SERS檢測中引入合適的生物洗脫體系——甘氨酸-HCI緩沖體系，以探究本方法的洗脫效果、穩定性和重復使用性。

1 材料與方法

1.1 材料 用Frens法制備得的金溶膠，粒徑大約30～40 nm。濃度1 mmol/L的苯硫酚和濃度1 mmol/L的4，4’-聯吡啶分子溶液。3.34 mg/L的羊抗人IgG。小牛血清白蛋白（BSA）（5%p）。pH 9的硼砂緩沖溶液。美國Full Moon BioSystems公司的生物芯片。TBS/0.1%Tween、TBS和三次水。

1.2 方法

1.2.1 制備金溶膠作免疫標記 用Frens法制備得到紫紅色渾濁的金溶膠，粒徑大約30～40 nm。將濃度1 mmol/L的苯硫酚1 μl和濃度1 mmol/L的4，4’-聯吡啶0.4 μl兩種標記分子溶液分別加入金溶膠中做標記，同時對標記溶膠進行多次離心，之后重新懸浮，以去掉多出來的標記分子。把3.34 mg/L的羊抗人IgG 5 μl加進標記溶膠中，在室溫下充分反應后，對標記溶膠再次離心，使其懸浮。選擇5%p的BSA即小牛血清白蛋白把表面的空位進行封閉，然后離心，在硼砂緩沖溶液（pH 9）的作用下，再實現溶膠的懸浮。

1.2.2 制作固相抗體 抗體使用的稀釋液是硼砂緩沖溶液（pH 9），稀釋的濃度以每毫升200～500 μg為宜，之后把稀釋好的液體滴在美國Full Moon BioSystems公司的生物芯片所做的固相基底上，形成拉曼光譜的采集點。環境濕度維持65%～75%，把上面所制作好的芯片放入，12 h后拿出，然后放在普通室溫中，干燥0.5 h。

1.2.3 組裝三明治結構的復合物和進行SERS檢測 把之前制得的抗體分別在BSA溶液（5%）中、人抗原的緩沖溶液中和標記免疫金溶膠溶液振蕩0.5 h、2～4 h和2 h，在每次震蕩后分別用三次水以及TBS/0.1%Tween、TBS和三次水依次沖洗，再分別用氮氣吹干。制得“固相抗體-待測抗原-標記免疫金溶膠”，它是三明治結構的復合物，可以用該抗體來進行SERS檢測。

1.2.4 儀器 使用的儀器與設備有LEO-1530型掃描電子顯微鏡、法國Jobin Yvon公司的HR800共聚焦激光拉曼散射儀、He-Ne激光器、電荷耦合檢測器和100倍的長焦鏡頭物鏡。

1.2.5 選擇洗脫體系 先用人抗原和羊抗人抗體制備抗原和抗體的復合物，第一次選擇強酸的鹽酸溶液（pH 2）進行洗脫，讓基底在強酸溶液中震蕩，震蕩2 h，把4，4’-聯吡啶作為免疫標記分子，第二次組裝三明治結構的復合物，用來進行SERS檢測，觀察SERS譜圖。在看到生物緩沖體系的作用后，采用甘氨酸-HCI（0.2 mol/L）生物緩沖體系，調節體系的pH 值，使pH為2，再把已制備好三明治夾心結構的基底浸入其中。觀察洗脫之前、洗脫5 h、洗脫10 h、洗脫24 h后測得的SEM圖。

1.2.6 洗脫后基底的穩定性 選擇羊抗人抗體抗原和苯硫酚，把后者作為標記分子，制備抗原抗體復合物。然后再用用甘氨酸-HCI體系對復合物洗脫，分別在暗處放置在10 d、1個月、2個月后，第二次制備三明治結構。分析經過靜置再次組裝的三明治結構SERS譜圖。

1.2.7 觀察載體的重復使用性 洗脫基底1、5、10次，再分別進行組裝，第二次抗原檢測以苯硫酚作為免疫檢測標記分子，通過分析之后的SEM圖來研究基底的可重復使用次數。

2 結果

首先通過改變pH值來試圖解離抗體抗原復合物，把洗脫2 h之后第二次組裝的三明治夾心結構復合物進行SERS檢測，譜圖上顯示有3個樣點有明顯的標記分子信號。洗脫后預期目的已基本達到，但是在少部分區域出現與標記分子4，4’-聯吡啶特征峰不一樣的雜峰和比較復雜的譜峰。該結果提示，只有強酸體系解離復合物并不利于維持生物環境。因此，分離的高選擇性和徹底性和保護體系生物活性的重要性是SERS檢測可再生性的關系因素，而使用生物緩沖體系后，既能防止pH變化對提取效果的影響，又能防止因pH值變化過度而導致的某些活性物質的變性。

之后采用甘氨酸-HCI（0.2 mol/L）生物緩沖體系進行洗脫，通過洗脫之前、洗脫5 h、洗脫10 h、洗脫24 h后測得的SEM圖進行分析得知，洗脫時間的選擇與抗體抗原分離的徹底性密切相關，且在洗脫時間為24 h時，抗原和抗體能充分分離，因此清除了抗體上的標記免疫溶膠和抗原，洗脫效果較好。

把洗脫后的基底分別靜置在陰暗處10 d、1個月、2個月后，第二次制備抗原抗體復合物。通過分析處理后二次制備的復合物SERS譜圖，可見a1振動模式特征譜峰在999和1 573 CTn-1的位置，而具有苯硫酚特征的峰值清晰。

洗脫基底重復1、5、10遍，然后再分別組裝，這一過程的SEM圖中，基底上的納米粒子和洗脫基底再組裝的次數呈反比，這與基底活性點被洗脫次數增加有關?；谏鲜鼋Y果，第二次抗原檢測以苯硫酚作為免疫檢測標記分子，基底洗脫后再組裝的次數增加，可達10次左右。在這一過程的SERS譜圖上，挑選重復1、5、10次的譜圖，這些圖譜在1000～1600/cm處具有分辨率不良的、較復雜的雜質峰。

3 討論

自從1974年Fleisehmarm發現吡啶的表面增強拉曼散射光譜（SERS）以來，SERS已經逐漸成為一種研究物質結構性質的快速有效的手段[5]。SERS標記免疫檢測是將SERS與標記免疫學相結合，利用SERS的高靈敏度和光譜選擇性，結合抗體抗原的特異反應作用而進行的納米標記免疫分析技術[6]，能避免溶液中類似物質的信號干擾，從而輕易獲取高分辨的表面分子信號[7]，由于具有高靈敏度、快捷、方便等特點[8]，SERS標記免疫檢測已被廣泛用于表面科學相關的領域，其應用領域的有效拓寬直接與活性基底的制備和增強機理的研究密切相關[9]，SERS免疫檢測已逐漸有成為新的免疫技術的趨勢[10]。

本次研究中，對抗原抗體復合物采用的洗脫的方式選擇的是甘氨酸-HCl緩沖體系，在洗脫1 d后，抗原和抗體能充分分離，因此清除了抗體上的標記免疫溶膠和抗原。優良的再生效果體現在復合物在經過重新組裝后，識別標記分子從而進行SERS檢測的能力不變，仍能使用的次數大約為10次。經過本研究的實驗結果證明，通過甘氨酸-HCI生物緩沖體系洗脫是一種洗脫基底再生效果好和穩定性強的方法。

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