藥用植物組織培養生產有效成分的影響因素研究進展

張敏敏，陳玉梁，趙 瑛，張運暉，羅俊杰

（甘肅省農業科學院生物技術研究所，甘肅 蘭州 730070）

植物是藥物的重要來源之一，人類利用藥用植物的歷史淵遠流長。我國藥用植物的種質資源非常豐富，達10 000種以上，且大多為野生資源。由于傳統中草藥的獲取方法是以采集和消耗大量的野生植物資源為代價，當采集和消耗量超過自然資源的再生能力時，必然會導致物種瀕危甚至滅絕，因此，利用植物組織和細胞的大量培養合成中藥有效成分成為實現中藥現代化的一條重要途徑［1］。適宜的離體培養條件下，植物組織和細胞培養物能像植物體一樣進行次生代謝，并積累次生代謝產物［2］。藥用植物的有效成分也屬于植物細胞所產生的次生代謝產物，如生物堿、黃酮、萜類、皂甙等。由于這些化合物結構復雜，人工合成困難，因此植物組織和細胞培養方法則展現出無可比擬的優越性。而藥用植物的組織和細胞培養價值如何，主要取決于其合成的有效成分與自然植株間的差異，而誘導成分的產生受到培養條件的多重影響。近年來國內外在基本培養條件和附加物的添加對藥用植物組織和細胞培養合成次生代謝產物的影響方面進行了許多研究，我們對該領域的相關研究進行了歸納和總結。

1 研究進展

1.1 外植體對合成次生代謝產物的影響

植物細胞雖均有全能性，但在實驗過程中，不同外植體的愈傷誘導率和愈傷生長狀態各不相同，且不同外植體誘導的愈傷組織其次生代謝產物的種類及產量也不盡相同。甘草以下胚軸為外植體時愈傷誘導率最高，且不同外植體誘導的愈傷組織中次生代謝產物含量不同，表現為下胚軸愈傷組織中總黃酮含量最高，子葉愈傷組織中甘草酸含量最高［3］；在對朱砂根愈傷組織的誘導中，各外植體的誘導率雖較為一致，但以胚根為外植體的愈傷組織中巖白菜素含量高于其它愈傷組織［4］。因此，外植體的選擇是利用植物組織和細胞培養生產藥用植物有效成分的前提。

1.2 培養基對合成次生代謝產物的影響

1.2.1 基本培養基 不同種類的基本培養基對植物組織培養及次生代謝產物的形成有很大的影響。如紫草在White培養基上能夠合成紫草寧衍生物，而在LS等培養基上則不能合成［5］；又如B5培養基有利于杜仲愈傷組織中總黃酮的形成，而1/2MS培養基則有利于綠原酸的積累［6］；嚴海燕等對硬紫草的研究表明，改良的B5培養基有利于愈傷組織的生長，而M9培養基有利于紫草素的形成，于是選擇了以B5培養基為生長培養基，而M9培養基為合成培養基的兩階段培養技術［7］。這種兩步培養法較好的解決了細胞生物量增長與次生代謝產物積累之間的矛盾，大大提高了目標產物的產率，現已較廣泛地應用于黃連、黃花蒿等藥用植物的培養中。

1.2.2 碳源 碳源不僅能為細胞生長提供能量，同時也是碳骨架的組成成分。在1987年，Smith等對長春花的研究即發現，以乳糖替代蔗糖可明顯提高組織培養物的生物量和長春質堿的產量［8］；李琰等對雷公藤的研究表明，蔗糖有利于雷公藤愈傷組織的生長，麥芽糖有利于其內脂醇的合成，葡萄糖則有利于其總生物堿的積累［9］。可見選擇適宜的碳源對藥用植物次生代謝產物的積累具有促進作用。

1.2.3 氮源 不同植物對NO3-和NH4+的利用率不同，且單獨以硝酸鹽或銨鹽為氮源，都不利于細胞的生長和次級代謝物的生成。因此，設置適宜的氮源及比例有助于細胞生長和次生代謝產物的生成。如在水母雪蓮懸浮細胞培養中，氮源總量為60～120mmol/L，且NO3-/NH4+比例為4∶2時有利于細胞增長及黃酮的合成［10］；而玫瑰茄懸浮細胞培養中，氮源總量為13.5 mmol/L時即足夠維持玫瑰茄細胞的生長和花青素的合成，且當NO3-/NH4+比例為25∶2和25∶4時細胞生長和花青素合成最佳［11］；甘草愈傷組織培養中，總氮濃度為60mmol/L，NO3-/NH4+為2∶1時，甘草愈傷組織中5種黃酮類化合物含量的總和達到最大值［12］。

1.2.4 生長調節劑 植物組織和細胞培養中最常用的生長調節劑是生長素和細胞分裂素。生長素主要包括2，4-D、IAA、IBA、NAA等，細胞分裂素包括BA、2ip、KT等。生長調節劑不僅對愈傷組織的生長和分化狀態起著重要的調節作用，同時對次生代謝產物的生產也具有重要的影響。如在三分三愈傷組織培養中，低濃度2，4-D能刺激生物堿的合成，但延緩生長；高濃度2，4-D雖能刺激愈傷組織生長但抑制生物堿的合成。而NAA既能促進愈傷組織生長又能促進生物堿的合成［13～14］。雷公藤愈傷組織培養中，2，4-D有利于雷公藤愈傷組織生長和總生物堿的積累，6-BA抑制愈傷組織生長但明顯促進內酯醇的形成［8］。可見植物生長調節劑是藥用植物有效成分目的化生產的重要因素之一。

1.2.5 光照 光照對藥用植物組織和細胞培養的影響主要體現在光強、光質及光照時間三個方面。如在不同光照強度下對虎杖愈傷組織進行培養，發現愈傷組織中白藜蘆醇的含量從大到小依次為弱光、強光、暗光，且弱光下白藜蘆醇的含量是同期所采野生品種的2倍［15］；又如以不同光質對朱砂根愈傷組織進行處理，發現綠光最利于巖白菜素的生成，藍光和白光次之，紅光最差［16］；在杜仲愈傷組織的培養中發現，12 h/d光照對愈傷組織的生長及綠原酸和總黃酮的合成有明顯的促進作用，黑暗雖不影響愈傷組織的生長，但卻抑制綠原酸和總黃酮的形成［17］。

1.2.6 pH 盛長忠等的研究表明，南方紅豆杉的愈傷組織生長及紫杉醇含量受pH的影響較大，pH為5.5時對愈傷組織生長最為有利，達接種量的3.84倍；但紫杉醇的含量較低且pH為7.0時，愈傷組織的生長量雖然相對較低，但紫杉醇含量卻是pH為5.5時的2倍多［18］。因此，選擇適宜的pH值對于植物組織的生長及次生代謝產物的合成也有一定的促進作用。

1.3 附加物對藥用植物組織和細胞培養及有效成分生產的影響

植物次生代謝產物是一大類小分子化合物，基礎含量一般都很低。而在生物受到脅迫或出于一定的誘導條件下，次生代謝產物的產量通常都有一定的提高［19］，因此，鹽脅迫、旱脅迫等脅迫因子以及誘導子的特殊誘導作用受到廣泛關注。同時，隨著次生代謝產物合成途徑的進一步闡明，前體物質和相關代謝酶的添加也成為提高目的產物的有效手段。

1.3.1 誘導子的應用 從植物病理學的角度講，誘導子是指在抗病生理過程中誘發植物產生植保素和引起植物過敏反應的因子，從細胞培養的角度講是指能促進植物細胞產生目的產物因子［20］。根據這個原理，近年來該項研究已成為國內外研究的熱點，并取得了較大的進展。如Lu等發現，誘導子的加入能使人參懸浮細胞中的皂甙含量達到細胞干重的2.07%，是未加誘導子的28倍［21］。Wang等發現，在紅豆杉的細胞培養中加入100 uM的茉莉酸甲酯作為誘導子，紫杉醇的含量能提高到對照的25.7倍［22］。文濤等以黑曲霉、啤酒酵母、青霉、灰葡萄孢的提取物為真菌誘導子對虎杖愈傷組織進行處理，結果為黑曲霉、青霉、灰葡萄孢3種真菌誘導子均對白藜蘆醇的合成有促進作用，其中黑曲霉作用最顯著，比對照提高了50.2%，而啤酒酵母提取物對白藜蘆醇的合成具有抑制作用［23］。楊世海等以稀土元素作為新型誘導子，也取得了喜人的結果，即低濃度的稀土元素Eu3+對甘草愈傷組織中黃酮類化合物的合成具有明顯的促進作用，且當其濃度為0.1 mg/L時最有利于黃酮類化合物的積累，總黃酮含量可為對照的2.7倍，其中甘草素的含量是對照的4倍［24］。可見選擇適宜的誘導子對藥用植物組織和細胞培養及有效成分的積累具有積極的促進作用。

1.3.2 前體物質及代謝酶的影響 前體物質指某一代謝中間體前一階段的物質，添加前體物質會影響植物組織和細胞的生長及次生代謝產物的合成。Zhao等在培養長春花細胞的系統中加入琥珀酸色氨和色氨酸等前體物質，發現處理后細胞產生的長春花堿和西蘿芙木堿是未經處理的4倍多［25］。Fett-Neto的實驗發現，在紅豆杉細胞培養中加入前體物質苯丙氨酸能使紫杉醇含量提高5倍［26］。而代謝酶的研究目前主要是應用現代分子遺傳學的方法分離和克隆出代謝途徑中的關鍵酶基因，并經過修飾和載體構建后轉化到目的植物的基因組中，從而構建目的代謝產物的轉基因高產細胞系。如Canel和Geerlings對長春花的相關研究發現，色氨酸合成酶和色氨酸脫羧酶與長春花細胞合成吲哚類和喹啉類生物堿相關，采用分子遺傳學方式超量表達這兩種酶后，生物堿產量達到200 mg/L的高水平，說明這兩種酶對長春花生物堿的合成具有明顯促進作用［27～28］。Yamamura等和Yamamoto等分別研究了桂皮酸羥化酶和牦牛酸氫醌羥化酶對紫草細胞中紫草素合成的影響，結果這兩種酶在紫草細胞內的表達量與紫草素的合成速度明顯相關，并已將其基因克隆，同時說明了通過外源基因調節紫草素的合成是可能的［29～30］。可見目的產物代謝途徑的研究對提高其產量具有重要的意義。

2 展望

1952年Routien和Nickel首次提出用植物細胞培養技術能生產有用次級代謝產物的觀點開始［31］，利用植物組織和細胞培養方法合成天然產物的研究便迅速地發展起來。如今已能利用紫草細胞培養物生產紫草寧，紅豆杉細胞培養物生產紫杉醇等已達到工業化生產水平，其他藥用植物利用組織和細胞培養方式生產有效成分也取得了很大的成就，但達到商業化生產水平的應用并不多，很多藥用植物組織和細胞的次生代謝產物含量不及原植物，導致生產成本過高。因此控制和調節藥用植物組織和細胞培養及有效成分合成中的相關可控條件，進一步加強對誘導子作用機制和目的產物代謝途徑的研究，對提高次生代謝產物的產量有著重要的現實意義，同時也將進一步推進利用藥用植物組織和細胞培養生產有效成分的工業化進程。

［1］ 張延紅，高素芳，朱田田，等.基本培養基及溫度和pH對黃芪組織培養的影響［J］.甘肅農業科技，2011（3）：7-9.

［2］ 傅經國，吳鳴建，趙天增，等.植物組織（細胞）培養在中藥有效成分合成中的應用［J］.世界最新醫學信息文摘，2004，43（2）：1056-1060.

［3］ 趙 晶，柳福智，藺海明.不同外植體對甘草愈傷組織誘導的影響［J］.廣東農業科學，2011，38（19）：36-37.

［4］ 彭光天，黃上志，黃仲立，等.朱砂根愈傷組織誘導及其巖白菜素含量的測定［J］.熱帶亞熱帶植物學報，2004，12（1）：51-56.

［5］ FUJITA Y，HARA Y，SUGA C，et al.Production of shikonin derivatives by cell suspension cultures of Lithospermum erythrorhizon ［J］.Plant Cell Rep.，1981，1：61～63

［6］ 李 琰，王冬梅，姜在民，等.培養基及培養條件對杜仲愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響［J］.西北植物學報，2004，24（10）：1912-1916.

［7］ 嚴海燕，曹日強.紫草愈傷組織培養中紫草素形成的影響因素［J］. 華北農學報，2002，17（2）：116-120.

［8］ SMITH J I，SMART N J，KURZ W G W，et al.Stimulation of indole alkaloid production in cell suspension cultures of Catharanthus roseus by abscisic acid［J］.Planta Medica， 1987， 53（5）： 470-474.

［9］ 李 琰，楊廣隸，馮俊濤，等.碳源及植物生長調節劑對雷公藤愈傷組織生長和次生代謝產物含量的影響［J］. 林業科學，2010，46（9）：34-39.

［10］ 邢建民，趙德修，李茂寅，等.碳源和氮源對水母雪蓮懸浮培養細胞生長和黃酮合成的影響［J］.生物工程學報，1999，12（2）：230-234.

［11］ 鄭穗平，郭 勇.主要營養成分對懸浮培養玫瑰茄細胞生長和花青素合成的影響［J］.廣西植物，1998，18（1）：70-74.

［12］ 楊世海，陶 靜，劉曉峰，等.培養基中碳源和氮源對甘草愈傷組織生長和黃酮類化合物合成的影響［J］.中國中藥雜志，2006，31（22）：1857-1859.

［13］ 鄭光植，梁 崢.三分三愈傷組織的生長、莨菪堿和東莨菪堿合成的化學調節［J］.植物學報，1977，19（3）：9-14.

［14］ 鄭光植，何靜波，王世林.三分三細胞懸浮培養中的激素調節［J］. 植物生理學報，1982，8（1）：53-58.

［15］ 文 濤，梁 莉，曾 楊，等.不同光照強度對虎杖愈傷組織的影響［J］. 中國中藥雜志，2007，32（13）：1277-1280.

［16］ 何雪嬌，賴鐘雄.光照和氮源對朱砂根愈傷組織生長及巖白菜素含量的影響［J］.福建農林大學學報（自然科學版），2012，41（5）：486-490.

［17］ 李 琰，王冬梅，姜在民，等.培養基及培養條件對杜仲愈傷組織生長及次生代謝產物含量的影響［J］.西北植物學報，2004，24（10）：1912-1916.

［18］ 盛長忠，王淑芳，王 勇，等.pH對紅豆杉愈傷組織生長PAL活性和紫杉醇含量的影響［J］.中草藥，2001，32（10）：929-931.

［19］ 蔣科技.藥用植物茉莉酸合成途徑關鍵酶基因的克隆與研究［D］.復旦大學，2007.

［20］王和勇，羅 恒，孫 敏.誘導子在藥用植物細胞培養中的應用［J］. 中草藥，2004，35（8）：3-7.

［21］ LU M B，WONG H L，TENG W L.Effects of elicitation on the production of saponin in cell culture of Panax ginseng［J］.Plant Cell Rep.，2001，20：674-677.

［22］ WANG Y D，YUAN Y J，WU J C.Induction studies of methyl jasmonate and salicylic acid on taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis var.mairei［J］.Biochemical Engineering Joumal，2004，19：259-265.

［23］ 文 濤，曾 楊，喻 曉，等.真菌誘導子對虎杖愈傷組織中白藜蘆醇合成的影響［J］.核農學報，2008，22（4）：435-438.

［24］ 楊世海，劉曉峰，果德安，等.不同附加物對甘草愈傷組織培養中黃酮類化合物形成的影響［J］.中國藥學雜志，2006，41（2）：96-99.

［25］ ZHAO J，HU Q，GUO Q-Y，et al.Effects of factors，and bioregulators，and synthetic precursors on indole alkaloid production in compact callus culture of Catharanthus roseus［J］.Microbiol Biotechol，2001，55（6）：693-698.

［26］ FETTNETO A G，MELANSON S J，NICHOLSON S A.Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and amino feed to cell cultures of Taxus cuspidate［J］.Biotechnology and Bioengineering，1994，44（8）：967-971

［27］ CANEL C，LOPES-CARDOSO M I，WHITMER S，et al.Effects of overexpression of strictosidine synthase and tryptophan decarboxylase on alkaloid production by cell cultures of Catharanthus roseus［J］.Planta，1998，205（3）：414-419

［28］ GEERLINGSA，HALLARDD，MARTINEZCABALLERO A，et al.Alkaloid production by a Cinchona officinalis‘Ledgeriana’hairy root culture containing constitutive expression constructs of tryptophan decarboxylase and strictosidine synthase cDNAs from Catharanthus roseus［J］.Plant Cell Rep.，1999，19：191-196.

［29］ YAMAMURAY，OGIHARA，MIZUKAMIH.Cinnamic acid 4-hydroxylase from Lithospermum erythrorhizon：cDNA cloning and gene expression［J］.Plant Cell Rep，2001，20：655-662.

［30］ YAMAMOTO H，INOUE K，LI S M，et al.Geranyl hydroquinone 3’-hydroxylase，a cytochrome P-450 monooxygenase from Lithospermum erythrorhizon cell suspension cultures［J］.Planta，2000，210：312-317.

［31］ ROUTIEN J B，NICKEL L G.Culturation of plant tissue［P］.US，US Patent 2，747，334，1952.