鏈脲佐菌素誘導糖尿病小鼠輪廓狀乳頭中味蕾特征變化

段 暉， 秦玉梅， 熊藝姣， 郭會林， 鄧少平

（浙江工商大學 食品學院，浙江 杭州310012）

味覺作為人類食物辨別、選擇及接受決定因素之一，用于食物及飲品中營養及有害物質的檢測，引起應急反應，導致食物的接受與回避，是人類不可或缺的生理功能。一旦味覺的感知能力顯著下降，將會導致人類的飲食偏好及食物攝入變化，從而最終影響人類的代謝并引發健康問題。近年來，糖尿病的發病率及患病率逐年升高，成為威脅人類健康的重大問題之一。糖尿病危害主要來自其并發癥，分為急性并發癥和慢性并發癥，其中慢性并發癥會引起神經病變，臨床表現為四肢自發性疼痛、麻木感、感覺減退。味覺紊亂和味覺損傷是其慢性并發癥的表現之一，在口腔中表現為味覺感知能力的下降[1]。但糖尿病病人味覺感知能力改變的機制目前尚不清楚。味蕾是味覺感受的外周器官，所以作者通過STZ誘導建立糖尿病模型小鼠[2]；利用蘇木精-伊紅染色法及免疫組織化學方法分析糖尿病小鼠味蕾形態變化和味覺信號轉導相關蛋白表達變化，為糖尿病人味覺感知能力的改變機制提供味覺方面的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 8周大雄性ICR小鼠，購自浙江省動物醫學研究院，恒溫動物房中飼養（溫度22±1℃，濕度 50%～60%），采用 12:12 h的白天/黑夜循環人工照明，自由進食和飲水。

1.1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素STZ:購自Sigma公司；檸檬酸，檸檬酸鈉，多聚甲醛:均購自上海生物工程有限公司；多克隆兔抗α-gustducin、PLCβ2及鼠抗SNAP25抗體:購自Santa Cruz公司；即用型SABC免疫組化試劑盒:購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 STZ誘導糖尿病小鼠模型建立 8周大雄性ICR小鼠，動物房適應一周后（平均體重25 g），稱重分組[3-4]（實驗組與對照組，每組40只小鼠），禁食16～17 h，實驗組小鼠腹腔注射STZ溶液（0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液中溶解，pH 4.4，滅菌，劑量180 mg/kg[5-6]）；對照組注射同等體積的檸檬酸鹽緩沖液。78 h后，使用One Touch Basic血糖儀（Lifescan，Milpitas，CA）測定小鼠血糖水平[7]，確定模型構建成功率（血糖水平≥11.1 mmol/L為建模成功）。

1.2.2 舌組織取材及輪廓狀乳頭中味蕾形態分析小鼠CO2致死后，取舌，舌剪至輪廓狀乳頭邊緣處，4%的多聚甲醛中固定24～48 h。取1 cm×0.5 cm×0.5 cm含輪廓狀乳頭的舌組織進行流水沖洗，常規石蠟包埋，10 μm連續冠狀切片，貼于蛋清包被的載玻片上，常規HE染色，實體顯微鏡記錄連續切片圖像，定量輪廓狀乳頭中味蕾數量；同一樣品連續數字圖像中隨機選取5張切片，每張切片隨機選取3～5個具有味孔味蕾,利用實體顯微鏡自帶軟件測量味蕾高度及寬度，通過以下公式計算味蕾橫截面積:

1.2.3 免疫組化和免疫熒光定量 α-gustducin、PLCβ2及SNAP25表達 小鼠CO2致死后取舌，4%的多聚甲醛中固定24～48 h后常規石蠟包埋，15 μm連續冠狀切片貼于蛋清包被的玻璃載玻片上，4℃短時間保存備用。切片脫蠟后檸檬酸鹽緩沖液中煮沸抗原修復，30%H2O2和甲醇 （1∶50） 溶液中30 min室溫孵育，PBS清洗后10%正常動物血清及5%的牛血清白蛋白溶液封閉，室溫下孵育20 min，加入一抗，4 ℃孵育過夜（α-gustducin，1∶100；PLCβ2，1∶200；SNAP25，1∶200），PBS 清洗，PLCβ2 及 SNAP25操作按照博士德即用型SABC試劑盒說明書，DAB顯色緩沖甘油封片后后，Leica實體顯微鏡及CCD記錄結果；α-gustducin加入Cy3偶聯IgG，緩沖甘油封片后Leica SP2激光共聚焦顯微鏡下觀察記錄結果。省略一抗或用PBS代替作為對照實驗。定量研究小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中陽性反應味蕾細胞數量，從小鼠舌面連續切片中隨機選取5張切片，每張切片選取3個最大橫截面積味蕾，10只小鼠共150個味蕾。

1.2.4 數據分析 采用Oringin 8.0對測定數據進行統計，數據用平均值±標準差表示，以P＜0.05表示差異顯著性。

2 結果與討論

2.1 輪廓狀乳頭中味蕾數量及形態變化

HE染色結果見圖1。對照組與糖尿病小鼠輪廓狀乳頭中味蕾總數及味蕾最大橫截面及之間無顯著差異，分別為 243.83±12.56 vs.231±7.78 （P=0.734 52）；1 621.79±232.78 vs.1 659±129.87 （P=0.899 45）。

圖1 輪廓狀乳頭中味蕾數量及形態Fig.1 Number and Morphology of circumvallate taste buds

2.2 α-gustducin、PLCβ2 及 SANP25 表達

α-gustducin、PLCβ2被認為是味覺信號轉導的關鍵蛋白（主要包括甜味、鮮味及苦味），而SNAP25是調節神經突觸小泡釋放神經遞質的重要蛋白[8]，與味覺信息傳遞息息相關，通過免疫組化技術分析了糖尿病小鼠與正常小鼠之間α-gustducin、PLCβ2及 SANP25表達差異。結果表明:α-gustducin、PLCβ2及SANP25在小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中呈強陽性表達，見圖2。而且糖尿病小鼠單個輪廓狀乳頭中味蕾中α-gustducin、PLCβ2免疫反應性陽性味細胞數分別為6.95±0.37和10.24±0.48，顯著高于對照組小鼠單個味蕾中α-gustducin、PLCβ2免疫陽性細胞數（P=0.015 47＜0.05 和 P=0.000 43＜0.01），對照組小鼠單個味蕾中α-gustducin、PLCβ2免疫陽性細胞數均為4.38±0.23（圖3a和b）。與上述兩種蛋白質的表達相反，糖尿病小鼠單個輪廓狀乳頭中味蕾中SNAP-25免疫陽性細胞數顯著少于對照組小鼠（P＜0.01），分別為 8.47±0.37 vs.11.57±0.53（圖 3c）。

圖2 α-gustducin、PLCβ2及SNAP-25輪廓狀乳頭中味蕾中表達Fig.2 α-gustducin，PLCβ2 and SNAP-25 immunoreactivity in circumvallate taste buds from diabetic mice

圖3 糖尿病小鼠及正常小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中αgustducin、PLCβ2與 SNAP-25表達差異Fig.3 Quantitative comparision of taste cells displaying different immunoreactive to marker in diabetes and control mouse circumvallate taste buds

3 結語

味覺是呈味物質溶解于口腔唾液后與味感覺受體作用，引起下游味覺信號傳導及釋放神經遞質，通過味覺傳入神經將外周味覺信息傳遞到大腦，最終經大腦分析后產生的感覺。味蕾（Taste bud，TB）是味覺感受的末端器官，主要分布于舌面上的各種味乳頭中（包括菌狀乳頭FF、葉狀乳頭FL和輪廓乳頭CV），一般由50～150個味覺細胞組成，而用于各種味覺感受的受體位于各種味細胞頂端的微絨毛上[9]。甜味、鮮味及苦味因為其受體均為GPCRs，具有相似的味覺信號轉導特性及相似的下游味覺信號轉導因子包括G蛋白α亞基 （αgustducin）， 磷酸脂酶 Cβ2 （Phospho-lipase Cβ2，PLCβ2）， 瞬時受體離子通道 （Transient receptor potential iron channel，TRMP5）， 而這些蛋白質的基因敲除小鼠的行為及神經反應結果，充分證明了其在三種味覺信號轉導中的作用[10-12]。所以糖尿病病人味覺感知能力的下降可能來自于味覺感受基礎的改變，包括味蕾解剖形態及味覺感受關鍵蛋白表達的變化。而本研究通過STZ誘導建立糖尿病模型小鼠，利用蘇木精-伊紅染色法及免疫組織化學方法分析糖尿病小鼠味蕾形態變化和味覺信號轉導相關蛋白表達變化結果表明，糖尿病小鼠與正常小鼠之間輪廓狀乳頭中味蕾數量及形態無顯著差異，表明味蕾解剖形態不是糖尿病小鼠味覺改變的主要原因。

α-gustducin、PLCβ2 及 SANP25 定量表達結果表明，與正常組小鼠相比，糖尿病小鼠輪廓狀乳頭中味蕾中上述味覺感受信號轉導蛋白顯著改變，用于味覺信號轉導的α-gustducin及PLCβ2表達量顯著增加。 這一結果與 Pai（2008）[13]和 Zhou （2009）[14]等以大鼠為實驗對象的研究結果一致的，但似乎與糖尿病病人的味感知能力下降相悖，至于上述變化的產生尚無合理解釋。與代表味覺信號轉導的關鍵蛋白α-gustducin及PLCβ2的結果相反，用于味覺信息傳遞控制神經遞質釋放的重要調節蛋白SNAP-25，同時也是味蕾信號傳遞前神經突觸細胞的標志蛋白，在糖尿小鼠中表達顯著減少，而這種蛋白表達量降低可能導致外周味覺信息無法正常傳遞到味覺傳入神經，進而導致味覺感知能力下降及味覺損傷。而大量研究也表明糖尿病引起神經系統退化和損傷[15]，這種作用在外周味覺感受上可能表現為味覺感受前神經突觸神經細胞數量的減少及與支配味覺細胞的味覺神經退化，我們研究中SNAP-25免疫結果支持了上述觀點，同時Pai等[16]研究結果也證實了糖尿病大鼠支配味蕾的蕾內神經及蕾外神經顯著退化。而這些神經的退化可能是導致味蕾中不同類型細胞數量變化的重要原因[17]。而各種味蕾細胞的異常生長致使正常味蕾內部各種類型細胞比例結構失調，從而最終導致味覺感知能力的下降。

綜上所述，利用STZ誘導構建糖尿病小鼠模型及簡單組織學免疫學方法，證明了糖尿病小鼠和正常小鼠之間輪廓狀乳頭中味蕾形態變化和味覺信號轉導相關蛋白質表達變化異?？赡苁菍е绿悄蛐∈笪独佼惓５闹匾颍饕憩F在確定了味蕾解剖形態不是糖尿病小鼠味覺改變的主要原因；糖尿病小鼠α-gustducin、PLCβ2表達量增加，這似乎與味覺損傷相悖。而用于味覺信息傳遞控制神經遞質釋放的重要調節蛋白SNAP-25卻減少，SNAP-25減少表明用于味覺信號傳遞體系的破壞，主要是神經信息的傳遞，從而導致味覺信號無法正常傳遞形成味覺異?；驌p傷?？傊?，本研究從一定程度上揭示了糖尿病引起味覺損傷的味覺方面基礎，這些可能為糖尿病病人食物設計提供一定理論依據。

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