氮溴化丙錠與聚合酶鏈反應結合的細菌活細胞檢測方法

史 菊（江蘇省泗洪縣人民醫院，江蘇 泗洪 223900）

疊氮溴化乙錠（EMA）不能穿過完整的細胞膜，但能與細胞膜受損后暴露出來的DNA結合，最終阻斷DNA分子的聚合酶鏈反應（PCR），可用于PCR檢測中區分死活菌。但是，EMA具有細胞毒性，使其在臨床診斷和食品安全中的應用受到一定的限制[1]。在細菌死活細胞的PCR選擇性擴增中，使用無細胞毒性的PMA代替EMA與PCR結合，對PMA對細胞致死作用進行有效的分析，同時對PMA的抑制作用進行考察，分析在死細胞DNA的PCR擴增中，PMA交聯受濁度、曝光時間以及最適濃度的影響。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：菌種為大腸桿菌Escherichia coli ATCC 8739，運用LB液體培養在160 r/min、30℃下進行24 h的培養。試劑為PMA（美國Biotium公司）；細菌通用引物1492R（5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC3′）和27F（5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG3′）；脫氧核糖核酸（dNTPs）、Taq酶等PCR反應體系（TaKaRa公司）。儀器用PCR儀器（Eppendorf公司）；Gel Doe 2000型凝膠成像系統（BIO-RAD公司）。

1.2 方法：①試驗樣品：取24 h培養的E.coli菌懸液10 ml，5000 g離心5 min，兩次懸浮1.5%的NaCl溶液，對其進行稀釋得到108 ml-1的菌體細胞數；②PMA處理：用二甲亞砜溶解PMA，配置成0.5 mg/ml的PMA溶液，避光，保存于-20℃冰箱。取500μl的菌懸液，置于1.5 ml離心管中，然后加入3μl 0.5 mg/ml的PMA溶液，控制PMA的終質量濃度為3μg/ml；充分混勻，避光培養5 min。用500 W的鹵素燈曝光，時間為5 min，在冰上放置光照交聯的樣品，距光源距離為20 cm；懸浮液交聯后10000 g離心，時間為5 min，得出沉淀并提取DNA[2]。此外，對于活細胞、死細胞的PMA處理中，進行PMA處理的為試驗組，而沒有進行PMA處理的為對照組；③PMA曝光交聯的濁度試驗：3μl PMA分別為加入500μl濁度為0、1、5、10、50、100 NTU的熱致死細胞懸浮液中，PMA的終質量濃度為3μl/ml，熱致死細胞懸浮液未經PMA處理的為對照組。3 min光照后進行PMA曝光交聯，對PMA光照交聯受濁度的影響進行考察；④不同條件制備死細胞的PMA處理；⑤DNA提取與PCR反應：曝光交聯PMA后，懸浮液10000 g離心，運用超純水對沉淀進行兩次重懸浮。對2×細胞裂解液進行加入，在沸水浴中煮沸10 min，使裂解細胞。懸浮液10000 g離心冷至室溫后，在微量離心管中進行上清液的轉入，保存溫度為-20℃。PCR反應體系為50μl，5μl 10×PCR緩沖液，0.5μl正反向引物，5μl上述上清液，41.7 nmoL/s Taq DNA聚合酶，4μl脫氧核糖核苷酸，用超純水補足體積。PCR反應的程序：第一步，預變性：溫度是94℃，時間為5 min；第二步為30個循環：94℃，30 s變性；55℃，退火1 min；72℃，延伸1.5 min。用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳，同SYBR Green I核酸染料對凝膠進行染色，通過Gel Doc2000凝膠成像系統進行成像。運用Image J軟件，對瓊脂糖凝膠上DNA條帶密度進行定量分析[3]。

2 結果

2.1 死細胞的PMA處理：對于沒有進行PMA處理的一組中，通過紫外燈照射、熱、異丙醇處理，對E.coli死細胞進行獲得，其DNA的PCR擴增差異并不明顯。另一組試驗對PMA處理進行了添加，得到的E.coli活細胞，其DNA的PCR擴增產物與上一組相比，條帶密度相差甚微，依據這一點，可以得知PMA處理不會對E.coli活細胞DNA的PCR擴增造成影響。70%異丙醇處理10 min與75℃水浴10 min得到的E.coli死細胞，在PMA處理后，PMA會對其DNA的PCR擴增進行抑制，也就是說對于E.coli死細胞中DNA的PCR擴增，PMA具有較好的抑制能力。借助紫外燈進行10 min的照射，使E.coli細胞死亡，不過PMA處理死細胞后，PMA就不會對其DNA的PCR擴增造成影響。分析這一原因，主要是因為異丙醇、紫外照射與熱造成的細胞死亡形成的原理有所差異，熱和異丙醇通過處理會對生物細胞的細胞膜造成破壞使其死亡，而紫外照射的處理會使細胞中核酸的結構受到損害，但細胞膜不會受到大的影響，其中PMA無法透過完整的細胞膜，與DNA進行結合。

2.2 PMA處理熱致死細胞/活細胞混合樣品的效果：對照組中沒有進行PMA處理，PCR產物的產量變化差異無統計學意義（P＞0.05）。試驗顯示，活菌受PMA的影響比較的小；如果活菌數＜50%，對照組與PMA處理組差異有統計學意義（P＜0.05），也就是說，E.coli熱致死細胞中，可以通過PMA對DNA的PCR擴增進行有效的抑制[4]。

2.3 PMA光照交聯受濁度的影響：通過分析可知，當濁度＜10 NTU時，對死細胞DNA的PCR擴增，PMA具備的抑制效用仍然有效；當濁度＞100 NTU時，PMA的抑制效果就會失去。對于PMA光照交聯受濁度的影響而言，光的透過性影響較為重要，其隨著濁度的增大，光的透性就會變得越弱，而DNA分子與PMA交聯的能力也就會越來越弱。相關研究結合PMA和EMA定量PCR，對厭氧發酵污泥中死菌、活菌細胞數的分析過程中，借助EMA、PMA，對試驗樣品進行了處理，不過洗脫罐污泥的外觀是深黑色的，這就使光線難以透過液體，曝光過程得到阻礙，也就對EMA、PMA與DNA的交聯產生了影響，為此，樣品中死細胞DNA的PCR擴增，無法通過EMA、PMA進行抑制。

3 討論

通過PCR與PMA的結合，可以對異丙醇處理、檢測熱處理致細菌細胞膜破裂的細胞死亡進行選擇，對于樣品中的PMA而言，其質量濃度＞3μg/ml時，曝光時間就會超過3 min，濁度小于10 NTU時，對于死細胞DNA的PCR擴增，PMA處理就會起到較好的抑制作用。PMA質量濃度＞50μg/ml時，活細胞DNA的PCR擴增就會受到一定的影響，濁度＞100 NTU時，PMA的抑制作用就會失去效果。另外，在濁度對PMA光照交聯的影響中，運用PMA與EMA結合的方法，進行厭氧發酵污泥中死菌和活菌細胞數量的分析中，得知即使通過PMA或EMA的處理，但由于洗脫罐污泥對光線的阻擋，時曝光過程中PMA或EMA與DNA的交聯受到了限制，使樣品中死細胞DNA的PCR擴增無法得到抑制。同時，由于EMA細胞毒性作用的影響，也就限制了EMA的有效應用，但通過無毒性的PMA與PCR相結合，其應用過程則更加安全適用。

[1]仝鐵錚,吳舒旭,施漢昌,等.基于PMA-定量PCR選擇性檢測技術的病原菌消毒特性研究[J].環境科學,2011,32(4):252.

[2]胡秀華,施漢昌,李 丹,等.水中輪狀病毒實時定量PCR外標準品的構建[J].環境科學,2008,29(2):111.

[3]司文會,訾言勤,屠一鋒.吖啶黃反應光度法測定脫氧核糖核酸含量的研究[J].光譜學與光譜分析,2008,28(2):412.

[4]李曉巖,劉啟才,彭 燕.腺病毒氣溶膠的實時熒光定量PCR檢測和綠色熒光蛋白活細胞檢測[J].環境科學學報,2007,27(5):785.