重樓皂苷對兔眼角膜B16惡性黑色素瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性

蘭海濤 曲 超 劉顯波 吳 琦

在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，重樓(Rhizoma Paridis)常被組成方劑用于癌癥的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)重樓對多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，而皂苷(saponins)是其主要藥效成分［1-3］。目前臨床上多以順鉑等鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療來治療多種實體腫瘤［4-5］。本研究應(yīng)用B16鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞兔眼角膜層間注射構(gòu)建的動物腫瘤模型，觀察重樓總皂苷對兔眼角膜B16惡性黑色素瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用，進(jìn)一步了解重樓皂苷在體內(nèi)的抗腫瘤活性，為臨床新藥的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物

由四川大學(xué)華西藥學(xué)院生藥教研室完成重樓皂苷化學(xué)成分的分離鑒定工作，提取得到滇重樓皂苷。順鉑溶于生理鹽水濃度為10 mmol/L，此濃度相當(dāng)于臨床化療體內(nèi)藥物峰值濃度。

1.2 B16鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞腫瘤動物模型

1.2.1 B16混懸液的配置 B16鼠黑色素瘤細(xì)胞株購自上海細(xì)胞生物研究所，由我院分子遺傳實驗室凍存?zhèn)溆谩＜?xì)胞復(fù)蘇后，常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)。對數(shù)增殖期細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，收集于無血清的培養(yǎng)液中，輕輕搖動，細(xì)胞懸液經(jīng)計數(shù)濃度為5×106/ml。錐蟲藍(lán)染色，檢測細(xì)胞活力在95%以上。

1.2.2 兔角膜層間B16細(xì)胞的接種 大耳白兔兔匣固定，蓓諾喜眼液表面麻醉3～5次。左手持有齒顯微鑷，固定結(jié)膜;右手用胰島素注射針，刺入角膜層間，刺入點(diǎn)距離角膜中心2～3 mm，在角膜層間前行，推注20 μl B16 混懸液。

1.3 動物實驗

日本大耳白兔18只，雌雄各半，體重在2.0～2.5 kg，來自四川省人民醫(yī)院動物房。B16細(xì)胞兔眼角膜接種7 d后分為3組，分別應(yīng)用重樓皂苷(250 μg/ml，重樓皂苷組)，順鉑(對照組)和生理鹽水(空白對照組)，于第7、14、21、28天進(jìn)行角膜層間注射給藥，瘤區(qū)多點(diǎn)注射。

1.4 裂隙燈觀察和色素記錄

大耳白兔兔匣固定，表面麻醉后，應(yīng)用裂隙燈顯微數(shù)字圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行照相，觀察B16色素細(xì)胞生長過程。應(yīng)用圖像分析軟件(Image-Pro Plus 6.0)計算黑色素面積，代表腫瘤生長情況。分別于接種當(dāng)天、第7、14、21、28天裂隙燈顯微鏡下觀察腫瘤生長。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組實驗動物注藥第7、14、21及28天時腫瘤的生長情況見圖1～圖3:可見空白對照組黑色素瘤細(xì)胞的生長隨時間延長呈明顯增長趨勢;重樓皂苷和順鉑均能抑制B16黑色素瘤細(xì)胞的生長，與空白對照組比較差異有顯著性(F=39.12，P=0.000);重樓皂苷組與順鉑組間黑色素瘤細(xì)胞生長情況比較無顯著性差異(P=0.966)。B16細(xì)胞兔眼角膜層間接種當(dāng)天、第7天及角膜層間注射生理鹽水、順鉑和重樓皂苷第28天時B16細(xì)胞實際生長情況，見圖4。

圖1 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長情況(空白對照組)

圖2 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長情況(順鉑對照組)

圖3 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長情況(重樓皂苷組)

圖4 兔眼角膜層間B16細(xì)胞生長情況

3 討論

中藥重樓是延齡草科重樓屬的總稱，中國藥典2000版、2005版收載為滇重樓和七葉一枝花的干燥根莖，民間使用的重樓品種較多，側(cè)重不同?，F(xiàn)代藥理表明其具有抗腫瘤、止血、免疫調(diào)節(jié)及心血管方面等活性，重樓主要活性成分為甾體皂苷，由于苷元不同、糖配基種類及鏈接方式不同，所以其活性也表現(xiàn)出差異性［6］。多個體外細(xì)胞毒性實驗研究表明重樓皂苷具有較好的抗腫瘤活性。顏璐璐等［7］以小鼠肺腺癌細(xì)胞株LA795為研究模型，研究滇重樓皂苷的抗肺癌活性，認(rèn)為重樓總皂苷成分在體外、體內(nèi)皆有強(qiáng)的抗肺癌作用。朱麗麗等［8］認(rèn)為重樓皂苷可通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗胃癌SGC-7910細(xì)胞株增殖的作用。畢葳等［9］應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜模型研究重樓皂苷抑制血管生長的活性，研究表明重樓可能是1種有效的血管生成抑制劑。陳志紅等［10］研究表明重樓總皂苷對人肺癌細(xì)胞A549有較高敏感性，毒性小，制備工藝簡單。順鉑是臨床上廣泛使用的一線廣譜化療藥物，對多種實體腫瘤有較好療效。

B16鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞，可以產(chǎn)生黑色素，作為細(xì)胞存活、生長和增生的可視指標(biāo);尤其在角膜透明的背景下，通過裂隙燈照相，利用圖像分析軟件，可以將細(xì)胞數(shù)量半定量化，所以利用B16角膜接種模型的優(yōu)勢可以篩選、評估抗腫瘤藥物的療效。本研究結(jié)果顯示與生理鹽水空白對照比較，重樓皂苷和順鉑均能抑制兔眼角膜層間B16黑色素瘤細(xì)胞的生長，差異有顯著性;重樓皂苷組與順鉑組間黑色素瘤細(xì)胞生長情況比較無顯著性差異。研究顯示重樓皂苷在B16細(xì)胞兔眼角膜動物模型上顯示具有較好的抗腫瘤活性。

本研究應(yīng)用兔眼角膜B16黑色素瘤細(xì)胞動物模型，顯示了重樓皂苷具有的抑瘤活性。重樓皂苷是重樓抗腫瘤作用的主要成分，相對重樓皂苷單體化合物而言，重樓總皂苷具有提取工藝相對簡單和多組分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的藥效優(yōu)勢;相對重樓醇提物等簡單提取方法得到的中藥粗提物而言，重樓總皂苷具有提高藥物療效，降低副作用等優(yōu)勢。重樓皂苷有望成為新的安全有效的抗腫瘤藥，有較好的開發(fā)利用前景。

［1］趙保勝，朱寅荻，馬 勇，等.中醫(yī)重樓研究進(jìn)展〔J〕.中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(11):267.

［2］王艷霞.重樓抗腫瘤活性成分的體外實驗研究〔J〕.包頭醫(yī)學(xué)，2008，32(4):196.

［3］王 羽，張彥軍，高文遠(yuǎn)，等.滇重樓的抗腫瘤活性成分研究〔J〕.中國中藥雜志，2007，32(14):1435.

［4］陳 劍，張鼎儒，李鴻波，等.誘導(dǎo)化療加放療同步化療非小細(xì)胞肺癌的療效觀察〔J〕.實用癌癥雜志，2012，27(2):187.

［5］金永東，梅 開，陳 萍，等.多西他賽聯(lián)合順鉑治療晚期頭頸部腫瘤的療效觀察〔J〕.腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2013，26(3):243.

［6］張 嫚，李彥文，李志勇，等.重樓屬藥用植物的研究進(jìn)展〔J〕.環(huán)球中醫(yī)藥，2011，4(2):145.

［7］顏璐璐，張艷軍，高文遠(yuǎn)，等.滇重樓皂苷成分體內(nèi)外抗肺癌活性研究〔J〕.中草藥，2009，40(3):424.

［8］朱麗麗，李惠芬.重樓皂苷對SGC-7910細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的實驗研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(6):1501.

［9］畢 葳，沈 葹，王鵬龍，等.重樓中幾個甾體皂苷類成分對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響〔J〕.中成藥，2012，34(8):1536.

［10］陳志紅，龔先玲，劉 義，等.重樓總皂苷對人肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用及對細(xì)胞周期的影響〔J〕.實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(15):2687.