對核仁組成區嗜銀蛋白外周血染色的探討

鐘禮瀑，萬祥輝

(1、江西省腫瘤醫院輸血科，南昌330029；2、江西省腫瘤醫院檢驗科，南昌330029)

·實驗研究·

對核仁組成區嗜銀蛋白外周血染色的探討

鐘禮瀑1，萬祥輝2

(1、江西省腫瘤醫院輸血科，南昌330029；2、江西省腫瘤醫院檢驗科，南昌330029)

目的探索一種簡便實用的能直接應用于外周血的核仁組成區嗜銀蛋白染色方法。方法取25mm×55mm的雙層濾紙貼蓋于經固定的血片上，自然光條件下滴加按1：2現配的銀膠溶液，放暗盒內30℃水浴染50min，水洗晾干，先低倍找到最佳部位后換油鏡觀察血膜染色后視野內背景清潔度、細胞結構和銀染顆粒著色情況，并另作30 min和40 min同等條件對照。結果本法采用濾紙貼蓋血膜面后，染液完全擴散于濾紙的時間較未用濾紙時以手工完全鋪展液面的時間(即染色前試劑曝光時間)明顯縮短，且利用了濾紙的過濾功能，使視野中雜質沉淀大為減少；適當延長染色時間能使細胞和銀染顆粒著色程度加深，更易于檢測識別。結論經此改進后的銀染法可用于自然光條件下血片嗜銀蛋白直接染色，適于各級醫療機構應用。

外周血；核仁組成區嗜銀蛋白；染色法

核仁組成區嗜銀蛋白(argyrophilic nucleolar organizer region proteins簡稱AgNOR)是rDNA轉錄過程中的調節蛋白，在核糖體和蛋白質的合成中起著重要作用。近些年，有關AgNOR在腫瘤病理診斷中的研究也不時可見報道，而其中的銀染法由于其簡單方便運用較多，但從報道來看，不管是在組織還是血膜中的應用其染色時間和溫度仍不盡相同[1-6]。由于試劑的光不穩定性，在不避光條件下直接滴加銀染應用液難免會受光分解，并在著色背景中產生大量棕黑色顆粒而妨礙檢測。為了克服這種現象，尋找一種能在自然光條件下應用于外周血膜的銀染方法，我們對此做了一些探索，經多次使用效果良好，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料(1)先將88%的分析純甲酸以重蒸水配成1%的溶液，再稱2g生化試劑明膠充分溶于100ml此液中成2%的甲酸明膠溶液(簡稱A液)；最后稱50g分析純硝酸銀充分溶于100ml重蒸水中(簡稱B液)，存于棕色磨口瓶中；(2)把雙層潔凈慢速定性濾紙緊貼著裁成25mm×55mm備用；(3)帶秒表功能的Nokia 1208手機一部。

1.2 方法

1.2.1 操作過程(1)吸取病人未抗凝新鮮血液，迅即推制12張血片，其中6張編1～6號以無水甲醇(分析純)固定5 min，潔凈自來水柔緩淋洗30s后晾干；(2)取備用的雙層濾紙貼放于其中1～3號(A組)血片上，另4～6號(B組)不放濾紙作同等條件對照，于每張玻片25㎜×55㎜面積內加600 μl計算所需應用液，按A液與B液1：2吸取各溶液量，立即放于干燥潔凈棕色瓶中，充分混勻成應用液；(3)迅速吸應用液600μl分別加到A、B兩組標本上，加液時啟動秒表，當A組應用液自行擴散和B組手動鋪散于整個標本面時，終止計時(以便計算A、B兩組單個標本蓋滿液面的時間，即染色前試劑曝光時間)，立即放暗盒內在30℃水浴箱作用50min；(4)染色完畢，以潔凈自來水輕柔淋洗30s，晾干，先低倍鏡找到細胞分布均勻的部位后再換油鏡觀察每份標本視野背景的清潔度、紅白細胞和銀染顆粒著色程度。另6張血片分別編7～9號(C組)與10～12號(D組)，在上述同樣方法和條件(但不計試劑曝光時間)下分別染色30min和40min(以便與A組對照觀察紅細胞、白細胞核、白細胞質和銀染顆粒著色程度)，水洗晾干鏡檢。

1.2.2 標本鏡檢時視野內背景清潔度、細胞和銀染顆粒著色程度判斷標準(1)視野中背景清潔度判斷標準：每份標本觀察10個視野，以7個(含)以上視野的結果作為該標本最終結果，在視野背景中無顆粒或僅極少量塵粒狀沉淀為-，當有G+球菌狀暗褐色顆粒或塵粒狀沉淀增多，但＜1/5視野面積為+，當G+球菌狀暗褐色顆粒或塵粒狀沉淀占視野面積1/5～2/5為2+，當G+球菌狀暗褐色顆粒或塵粒狀沉淀占視野內面積＞2/5～3/5為3+，當G+球

菌狀暗褐色顆粒或塵粒狀沉淀占視野內面積＞3/5～4/5為4+，G+球菌狀暗褐色顆粒或塵粒狀沉淀占視野面積＞4/5～5/5(滿視野)為5+；(2)細胞和銀染顆粒著色程度判斷標準：每份標本觀察10個視野，以7個(含)以上視野內細胞核、細胞質與銀染顆粒未著色為“-”，呈黃白色為±，呈檸檬黃為+，呈桔黃色為2+，呈金黃或暗紅色為3+，呈棕黑色為4+。

2 結果

2.1 A組滴加應用液后染液自行擴散和B組手動助其鋪散的時間比較滴加應用液后1～3號標本染液自行完全擴散的時間分別為10.22s、9.19s和9.06s，平均9.63s；4～6號標本手動助染液完全鋪散的時間分別為19.41s、13.59s和15.09s，平均16.03s；

2.2 鏡檢時視野內背景清潔度在鏡下A組標本視野內背景清潔度均為-，B組標本視野內背景清潔度均為5+；

2.3 雙層濾紙貼蓋染色30 min、40 min、50 min后紅細胞、白細胞核、白細胞質和銀染顆粒著色程度(1)30min染色后C組3份標本視野內紅細胞為-、白細胞核為±、白細胞質為-，銀染顆粒為-；(2) 40min染色后D組3份標本視野內紅細胞為±、白細胞核為+、白細胞質為-，銀染顆粒為+；(3)50min染色后A組3份標本視野內紅細胞為+、白細胞核為2+、白細胞質為±，銀染顆粒為3+。3種不同染色時間具體染色效果見表1。

表1 30 min、40min、50 min3種不同染色時間雙層濾紙貼蓋染色效果對照

3 討論

AgNOR銀染一步法因無需特殊儀器，試劑組成中的硝酸銀和明膠也易得，操作過程相對簡單，人們樂于采用，但在有自然光的條件下要染出效果良好的血片并非易事，因硝酸銀液一旦遇光即分解析出，產生沉淀，加上明膠溶液本身具有一定的黏附性，會促使沉淀的聚積，導致在染過的標本內形成大量沉渣，嚴重干擾銀染顆粒的檢測。故在無暗室條件下染色若要減少沉淀形成，就必須盡量縮短試劑染色前曝光時間。本實驗采用雙層濾紙貼蓋血膜染色，干燥濾紙的強烈吸水性和其致密纖維網孔具有的巨大表面積對試劑的虹吸作用均能使試劑以極快的速度擴散于整個血膜，其擴散速度明顯快于手工鋪散試劑的速度，縮短了染色前試劑的曝光時間，濕潤后的濾紙既可防止試劑蒸發干燥，還能濾除已形成的顆粒，這些作用相互疊加可大大減少沉淀生成，使染色背景變得清爽。在反應時間上，雖本法較有的報道[2-4]在染色時間上略長數分鐘，但本法免除了復染水洗等程序，節省了試劑和后續過程所需的時間。再則，由于銀染陽性呈現的黃色不甚醒目，觀測的銀染顆粒往往較微小，中性粒細胞核質較淋巴細胞核質疏松，其著色也較淋巴細胞核略淺，本著染色效果優先的原則，本實驗經50 min染色后，紅細胞、白細胞核和銀染顆粒的著色程度均比其染色時間短的兩組深染，故我們認為在30℃的常溫條件下染50 min能更好地體現出本染色的應用價值，適于各級醫療衛生機構推廣。

[1]孟江萍,尹一兵,鄧一平.宮頸癌脫落細胞核仁形成區嗜銀蛋白定量研究[J].江西醫學檢驗,2005,23(4):339.

[2]楊玉琴.胸、腹水細胞AgNORs的檢查對良惡性腫瘤診斷的體會[J],江西醫學檢驗,2002,20(2):106.

[3]陳中英.骨髓中粒細胞系統分析[J].中國煤炭工業醫學雜志, 2006,9(9):930.

[4]韓益玲,鐘璐,陳芳源,等.急性非淋巴細胞白血病細胞核仁組織區相關嗜銀蛋白的研究[J].上海交通大學學報(醫學版),2009,29(1): 74.

[5]李冰,徐麗萍.核仁組成區嗜銀蛋白染色影響因素分析[J].濱州醫學院學報2010,33(3):217.

[6]杜豫,許良中.惡性淋巴瘤核仁組成區染色對惡性程度診斷的價值[J].白血病,1995,4(4):197.

R446.11+1

A

1674-1129(2013)02-0131-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.009

江西省衛生廳科技計劃項目(20091216)

鐘禮瀑,男,本科,學士,主任技師,擅長血液細胞形態、生化和輸血檢驗技術。