一種從骨髓血凝塊中分離間充質干細胞的方法

李志勇 王恒湘 畢曉云 黃 舒 郭子寬 郭志坤

一種從骨髓血凝塊中分離間充質干細胞的方法

李志勇 王恒湘 畢曉云 黃 舒 郭子寬 郭志坤

目的探討一種從骨髓血凝塊中分離培養間充質干細胞的簡易方法。方法采集肝素化骨髓標本7份，部分加入凝血酶以模擬血液凝固過程，并于0、8和16 h分別使用尿激酶或機械處理，分為尿激酶處理組、機械處理組、凝固未處理組及未凝固對照組。各組標本經氯化銨溶解紅細胞后，分別進行成纖維細胞集落形成單位（CFU-F）和MSC傳代培養。計每組CFU-F及第0、1和2代MSC數量。流式細胞儀測定細胞表型，組織化學法檢測細胞體外成骨和成脂肪能力。結果尿激酶處理組樣本CFU-F數平均為（33.71±23.54），接近于未凝固對照組樣本（40.43±21.29）（n=7，P＞0.05），顯著高于機械法處理組（13±11.91）（n=7，P＜0.01）和凝固未處理組（3.71±3.89）（n=7，P＜0.01）。儲存8或16 h后的標本，各組CFU-F形成能力下降，而未凝固對照組和尿激酶處理組數量仍顯著高于另外兩組（P＜0.05）。標本儲存不同時間進行MSC傳代培養，未凝固對照組及尿激酶處理組細胞數量無明顯差別，但均顯著高于凝固未處理組及機械處理組。各組MSC均表達CD73和CD90，不表達CD31和CD45。經特異誘導后，各組MSC均呈現堿性磷酸酶活性，細胞內出現親油紅O染料的脂肪滴。結論對于已經凝固的骨髓標本而言，尿激酶預處理是分離培養MSC的良好途徑。

間充質干細胞骨髓凝固尿激酶分離

間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSC）是一種具有造血支持及免疫調節活性的成體干細胞，具有向成骨細胞、成軟骨細胞和成脂肪細胞分化的能力，已經進入多種疾病的臨床試驗及臨床應用階段，包括移植物抗宿主病、心血管疾病及肌肉骨骼疾病等[1-2]。MSC具有較低的免疫原性，異體骨髓MSC已經應用于造血干細胞移植，用于某些并發癥的預防與治療。但是，MSC分化的細胞具有較強的免疫原性，如MSC分化形成的成骨細胞，與MSC明顯不同，高表達HLA-DR，抗原性顯著增強[3]。因此，在某些情況下，必需使用自體MSC移植，以免引起移植細胞的排斥。脂肪組織也是MSC重要的來源，但骨髓采集方便，在進行骨及軟骨缺陷的修復時，通常抽吸患者骨髓，用來分離培養MSC[4]。然而，有時骨髓很難抽取，且在抽吸后標本極易凝結成塊，一些高凝狀態的患者更是如此[5-6]，從而導致所獲得MSC的數量下降乃至培養擴增失敗。為解決這個實際問題，我們探討了一種從骨髓血凝塊中分離出間充質干細胞的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

7份健康人骨髓標本來自空軍總醫院血液科，均為健康骨髓供者。骨髓標本采集符合空軍總醫院人體標本采集和使用規范。

α-MEM培養基（Sigma公司）；胎牛血清（Stem Cell公司），為經篩選后適用于人MSC培養的專用血清；人凝血酶（Sigma公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫藥公司）；尿激酶注射用粉針（珠海塞隆藥業有限公司）；PE標記的小鼠抗人CD31、CD45、CD73和CD90單克隆抗體（BD公司）；細胞分化誘導試劑如地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤和吲哚美辛（Sigma公司），β-甘油磷酸鈉鹽和維生素C鈉鹽（Fluka公司）；堿性磷酸酶組化染色試劑盒（86C-1KT）（Sigma公司）。

1.2 標本處理方法

將骨髓標本充分混勻，用臺盼藍試劑拒染法計數活細胞數，PBS調整細胞濃度至1×107cells/mL。在CFU-F測定實驗中，取1 mL混勻骨髓液分為12等份，每份約含106個有核細胞，向其中9份中加入凝血酶，使其終濃度為1 U/mL，放置37℃反應1 h。在細胞傳代實驗中，取12等份骨髓樣本，各含107個有核細胞，其中9份加入凝血酶，37℃反應1 h。上述12份標本，根據不同處理分為4組：尿激酶處理組、機械處理組、血凝塊未處理組及未凝固對照組（未加入凝血酶），每組3份，分別于0、8和16 h進行相同處理。凝血塊樣本處理包括機械處理和尿激酶消化兩種方式，即用剪刀將骨髓凝塊剪成體積約為1 mm3的碎塊，或向標本中加入尿激酶（終濃度為50 000 U/mL），放置于37℃搖床中，120 r/min消化20 min。之后，所有樣本經氯化銨緩沖液處理，以溶解其中的紅細胞[7]。收集不同標本，用于后續實驗。

1.3 CFU-F的培養及計數

將含有106個有核細胞的標本，重懸于含10% FCS的α-MEM培養基中，接種于直徑為100 mm的培養皿內，37℃、5%CO2條件下培養5 d，補充新鮮培養基。培養12 d時，PBS洗滌去除非貼壁細胞。0.1%甲醛固定，瑞氏-吉姆薩染色。計數直徑大于0.5 mm的集落。

1.4 MSC的傳代培養

將含有107個有核細胞的處理及未處理標本，重懸于含10%FCS的α-MEM培養基中，按文獻報道的方法進行MSC傳代培養[8-10]。當未凝固對照組貼壁細胞生長融合至80%時，將各組細胞用胰酶消化計數，按6 000 cells/cm2的密度重新接種于培養皿。臺盼藍拒染法計數第0、1和2代活細胞總數。

1.5 細胞表型分析

按文獻報道方法進行[8-10]。簡言之，收集第2代MSC，PBS洗滌后計數。細胞懸液中加入單克隆抗體，室溫避光反應30 min。PBS洗滌兩次后重懸細胞，流式細胞儀分析，FACSCalibur收集數據，WinM-di 2.9軟件分析結果。

1.6 體外成骨和成脂肪能力測定

按本室常規方法進行[11]。即，將MSC按照l×l04個細胞/孔接種于24孔培養板中。成骨能力測定時，加入成骨誘導體系培養液（地塞米松0.1 mol/L、β-甘油磷酸鈉鹽10 mmol/L和抗壞血酸磷酸鹽50 mol/L），培養第2周后，按堿性磷酸酶檢測試劑盒操作步驟進行堿性磷酸酶染色。成脂肪能力測定時，加入成脂誘導體系培養液（地塞米松1 mol/L、IBMX 0.5 mmol/L、吲哚美辛100 mol/L)。體外培養10 d后，PBS洗滌，0.2%多聚甲醛固定，油紅O染色。

1.7 統計學分析

計數資料均以均值±標準差表示。所有數據經t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理組CFU-F數量

CFU-F是檢測某一樣本MSC含量的代表性指標。為顯示不同處理組MSC含量，將不同處理組有核細胞進行CFU-F培養，12 d后計數。結果表明：各骨髓血凝固樣本所得的CFU-F，均低于未凝固骨髓樣本。其中，尿激酶處理組樣本CFU-F平均值為（33.71±23.54），接近于未凝固對照組（40.43±21.29）（n=7，P＞0.05）。兩者均明顯高于機械法處理組的結果（13±11.91）（n=7，P＜0.01）和血凝塊未處理組（3.71±3.89）（n=7，P＜0.01）。將標本保存8或16 h后，所有組別樣本中CFU-F的數目明顯下降，但是未凝固對照組及尿激酶處理組仍明顯高于其他兩組（圖1）。

2.2 不同處理組收獲MSC數量

未凝固對照組原代貼壁細胞數（38.86±17.4）×104，尿激酶處理組為（38.57±16.78）×104，均明顯高于機械處理組的（18.57±13.69）×104（n=7，P＜0.01）及未處理組的（13.14±8.39）×104（n=7，P＜0.01）。第1代及2代細胞總數，同樣存在相似的差異。

2.3 MSC的鑒定

為觀察不同組別所獲得的細胞是否為MSC，對第2代貼壁細胞進行了生物學特性分析。結果發現：所有貼壁細胞均呈成纖維細胞樣；不表達CD31（內皮細胞標志）和CD45（血細胞標記），均一表達間充質細胞標記CD73，而且高表達干細胞標記CD90。進一步分化功能分析證實，這些細胞可在體外分化為成骨細胞和成脂肪細胞。因此，所獲細胞符合MSC的最低標準[10]，不同處理對細胞本身的特性無明顯影響（圖2）。

圖1 不同組別CFU-F和MSC數量Fig.1CFU-F and MSC numbers of different groups

圖2 MSC的表型及分化能力鑒定。上：流式細胞學結果，顯示細胞表面抗原；下：不同組別Oil-Red染色和NBT染色Fig.2Representative results from flow cytometric analysis on cell phenotype(upper)and in vitro differentiation assay (lower).The antigenic markers are indicated.Adipogenesis was revealed by Oil-red staining and osteogenesis was examined by NBT/BCIP staining for alkaline phosphatase

因此，從收獲細胞數量上講，以上結果提示尿激酶處理骨髓凝塊是分離培養MSC的一種有效方法。

3 討論

MSC是一種存在于胚外及胚內組織的未分化多能細胞，具有分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和骨髓基質細胞的能力[12-14]。與造血干細胞不同，MSC易于分離和培養，體外增殖能力旺盛[12]，且具有特征性的造血支持及免疫調節功能[1，13]。因此，MSC作為組織修復的種子細胞已經受到廣泛關注。然而，骨髓中MSC含量相當有限，需要體外擴增后用于臨床。臨床骨髓抽吸過程中，尤其對于那些處于高凝狀態的患者，總會出現骨髓凝結成塊的現象，導致MSC培養擴增困難。

為解決該問題，本實驗通過向凝固16 h內的骨髓凝塊中加入尿激酶，使凝塊溶解。流式細胞學分析和分化實驗證實，培養后的細胞高表達干細胞標記，而且，仍具有成骨和成脂肪能力，表明細胞生物學未受到影響。因此，使用尿激酶消化法從骨髓凝塊中分離MSC，所獲細胞數量接近于未凝固標本，又可保證細胞質量，方法簡單可行，是一種可推廣的實用手段。

已有研究證實，間充質干細胞表達尿激酶受體，而且，受體的活化會啟動其遷徙過程，促進干細胞動員[15]。由此可以推測，尿激酶處理骨髓凝塊過程中，除酶消化分解凝塊外，MSC從凝塊中遷移至消化液中，也可能是凝塊釋放MSC的途徑。然而，必須指出的是，經過尿激酶刺激后，MSC可釋放更多的促血管再生細胞因子，如bFGF、VEGF和IL-8等[16-17]。因此，從骨髓標本凝塊中分離的MSC，是否具有更強的促血管新生活性，或因此促進實體瘤的增殖，值得進一步研究闡明。

總之，利用尿激酶消化法從骨髓凝塊中分離MSC，方法簡單可行，獲得細胞數量較穩定。但是，該方法所獲MSC的詳細生物學特性尚未明確，仍需從不同角度研究探討，以期用于相應臨床試驗研究。

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An Approach of Isolating Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow Clots

LI Zhiyong1,WANG

Hengxiang2,BI Xiaoyun3,HUANG Shu3,GUO Zikuan4,GUO Zhikun1.1 Key and Open Lab for Tissue Regeneration, Xinxiang Medical University,Henan 453003,China;2 Department of Hematology,General Hospital of Air Force,Beijing 100036,China;3 Department of Cell Therapy,Guangzhou Hospital of Developmental District,Guangzhou 510730,China;4 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China.Corresponding author:GUO Zhikun(E-mail:gzk@xxmu.edu.cn).

ObjectiveTo establish an easily-handled method to isolate and culture-expand MSC from marrow clots.MethodsSeven heparized bone marrow samples were harvested from healthy subjects.Thrombin were added to part of the samples to mimic the coagulation process.After being stored for 0,8 and 16 hours,all the samples were divided into 4 groups:urokinase-treated group,mechanically-cut group,untreated group and control group.The clots were mechanically cut into pieces or treated with urokinase,followed by red blood cell lysis with ammonium chloride.Colony-forming units of fibroblast(CFU-F)and MSC culture were further developed,and the numbers of CFU-F and MSC at passage 0-2 were counted.The phenotypic features were analyzed with flow cytometry.Histological staining was used to observe the in vitro osteogenesis and adipogenesis.ResultsThe average CFU-F number of urokinase-treated group was 33.71±23.54,which was comparable to that of control group(40.43±21.29)(n=7,P＞0.05)).Both of them were significantly higher than those of mechanically-cut group(13±11.91)(n=7,P＜0.01)and untreated group(3.71±3.89)(n=7,P＜0.01).The CFU-F numbersdecreased after samples were stored for 8 or 16 hours,but those of control and urokinase-treated group remained higher than the other two groups.MSC culture from samples stored at different times was developed.The cell numbers at different passages were similar between control and urokinase-treated group,while they were greatly higher than those from untreated and mechanically-cut group(P<0.05 for all time points and passages respectively).MSC from different groups expressed CD73 and CD90 and they were negative for CD31 and CD45.After specific induction of differentiation,the cells became positive for alkaline phosphatase activity and intracellular Oil-red O-binding lipid droplets appeared.ConclusionThe results here suggest that urokinase pretreatment is an optimal strategy to culture mesenchymal stem cells from coagulated marrow samples.

Mesenchymal stem cells;Bone marrow;Coagulation;Urokinase;Isolation

Q813.1+1

A

1673－0364（2013）03－0125－04

2013年4月9日；

2013年5月20日）

國家自然科學基金（30971068）；廣州市開發區科技局課題（2009Q-P081）。

453003河南省新鄉市新鄉醫學院組織再生重點實驗室（李志勇，郭志坤）；100036北京市空軍總醫院血液科（王恒湘）；510730廣東省廣州市廣州市開發區醫院南方生物診治中心（畢曉云，黃舒）；100850北京市軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所實驗血液學研究室（郭子寬）。

郭志坤（E－mail：gzk@xxmu.edu.cn）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.002